血小板-抗原抗体检测参考课件

1血小板抗原抗体广州医科大学附属第五医院输血科2目录血小板相关疾病血小板抗原血小板抗体抗体检测及交叉配血3血小板抗原血小板抗原泛指存在于血小板膜的能够刺激机体产生抗体,并能与之结合的血小板膜蛋白质和糖分子.血小板相关抗原:红细胞血型抗原：ABO、Lewis和P系统抗原等，无RH抗原白细胞抗原：HLA抗原血小板特异性抗原（humanplateletantigen，HPA）4血小板抗原血型抗原：ABO、Lewis和P系统抗原等，无RH抗原来源：血小板表面的A、B抗原来源主要有两个：大部分是血小板本身所固有（从巨核细胞分化而来）；小部分是从血浆吸附而来。如体外将O型血小板和A或B型血清温育，血小板就会带上A或B抗原。不同个体间血小板膜ABH抗原量存在差异;同一个体的每一个血小板抗原量差别非常大，由此可以解释有些人输入ABH不相容血液后,一部分输入的血小板迅速被破坏,而另外的血小板其生命力不受影响.5血小板抗原白细胞抗原：HLA抗原血小板存具有HLA-Ⅰ类抗原类抗原，主要是HLA-A和HLA-B位点的抗原（少量表达的HLA-C抗原）。HLA-Ⅰ类分子为血小板的固有蛋白，少量从血浆中吸附。血小板HLA抗原的免疫原性比白细胞弱。6血小板抗原血小板特异性抗原（humanplateletantigen，HPA）主要位于人血小板膜的一大类抗原,称之为血小板特异性抗原高频率抗原以“a”表示，低频率抗原以“b”表示人血小板同种抗原（HPA）自1959年被发现以来，迄今已经检出24个抗原，其中HPA-1，-2，-3，-4，-5，-6,-15被血小板命名委员会（PNC）列入抗原系统，包含14个对偶抗原，而HPA-7-14，-16,-17因为对偶抗原未检出而未达到系统命名标准。7血小板抗原8血小板抗原9血小板抗原24个抗原主要分布在糖蛋白GPⅡb，GPⅢa，GPⅠb，GPⅠa以及CD109上；GPⅢa（CD61）携带9种HPA抗原，分别为HPA-1，HPA-4，HPA-6bw，HPA-7bw，HPA-8bw，HPA-10bw，HPA-11bw，HPA-14bw，HPA-16bwGPⅡb（CD41）是跨膜蛋白，细胞外116kD的重链，通过二硫键与22kD的轻链共价结合。GPⅡb上携带HPA-3和HPA-9bw；10血小板抗体抗体分类疾病HLA/HPA抗体其它抗体同种抗体格兰茨曼血小板功能不全病抗GPⅡb/Ⅲa抗体同种异体抗体新生儿同种异体免疫性血小板减少症HPA1b(78%),HPA5b(19%)HPA-2,3,4(3%),HPA-15,HPA-9bw,Anti-CD36血小板输注无效症HLA-I抗体50~80%17~25%(日本人为HPA-2b),HPA-15,anti-CD36极少数为ABO抗体血小板输血后紫癜HPA-1a,HPA-1b,HPA-2b,HPA-3a,HPA-3b,HPA-15,anti-CD36少数为抗GPIa/IIa抗体被动同种异体免疫性血小板减少症HPA-1a,HPA-5b移植相关同种异体免疫性血小板减少症HPA-1a,HPA-3,HPA-5b自身抗体自发性血小板减少症多数位于GPⅡb/ⅢaGPIb/IX/V，少数位于GPIV/V和GPIa/IIa继发于母体自发性血小板减少症同上药物依赖性抗体奎宁/奎尼丁抗体所致疾病抗原位于GPⅡb/Ⅲa和GPIb/IX肝素抗体所致疾病抗原表位是PF411抗体检测及交叉配血采取预防和治疗措施避免流产、出血等血小板相容性检测抗原定型抗体检测建立血小板供者库筛选基因型相容的供者避免血小板抗体的产生诊断血小板免疫性疾病交叉配型筛查血小板相容性供者减少血小板输注无效避免紫癜、出血和死亡12血小板抗原定型血清学定型即用已知特异性抗体检测血小板血型抗原缺点：特异性抗体来源困难---人血清中血小板抗体通常为多特异性---单克隆抗体匮乏，目前国际上仅有HPA-1a单抗，无其它HPA单抗。基因定型限制性片段长度多态性分析（RFLP）序列特异性寡核苷酸聚合酶链反应(PCR-SSO)序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)HPA-1HPA-2HPA-3HPA-4HPA-5HPA-15abababababab阳性对照条带等位基因条带1bb2ab3bb4aa5aa15aa13血小板抗体检测血清学ELISA法(酶联免疫试验)血小板抗原单抗特异性固相化法(MAIPA)固相血小板免疫血清学试验(SPISA)简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA)流式细胞仪改良抗原俘获(ELISA)免疫荧光试验14简易致敏红细胞血小板血清学试验SEPSA血小板谱细胞（三人份O型混合血小板）反应板（已包被血小板单抗）血小板单层阳性反应阴性反应患者血清/血浆抗人IgG指示红细胞（人IgG致敏红细胞）50g,5min离心洗涤3次50μl/孔洗涤5次水浴30min阳性阴性50μl/孔各50μl/孔200g,5min离心200g,5min离心15简易致敏红细胞血小板血清学试验SEPSA直接测定法血小板表面结合血小板抗体的测定间接测定法血清内抗血小板抗体的测定交叉配血试验选择配合的血小板供体质量控制阴阳性对照16ELISA法(酶联免疫试验)单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法（MAIPA）：该法先制备羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，将鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体和带有抗体的血小板共同孵育，再将孵育后的复合物加入多孔板，孵育，洗涤，最后加入酶联羊抗人抗体和酶反应底物后显色，定量测定血小板抗体。17血小板相关疾病临床上由于血小板血型抗原引起的血小板减少症主要有5种：1.血小板输注无效（PTR）2.输血后紫癜（PTP）3.新生儿同种免疫血小板减少症（FMAIT/NAIT）4.被动免疫血小板减少症（PAT）5.移植相关的同种免疫血小板减少症（TAT)18血小板相关疾病血小板免疫性疾病血小板输注无效症新生儿血小板减少症输血后紫癜自身免疫性血小板减少症药物引起的血小板减少症移植相关的血小板减少症血小板抗原同种异体抗原HLA-I,HPA,ABH同种抗原GPⅡb/Ⅲa,CD36自身抗原GPⅡb/Ⅲa,GPⅠb/Ⅸ药物依赖性抗原肝素、奎宁等非特异性抗原临床病症淤点淤斑流产（颅内）出血死亡19血小板相关疾病-血小板输注无效(PTR）Platelettransfusionrefractoriness,PTR:患者接受充足治疗剂量（≥2.5x1011个/次）的血小板输注后，血液循环中血小板计数未见有效提高，临床出血表现未见明显改善，处于血小板治疗不应状态。一般临床上认为至少有2次及以上输注血小板效果不佳才能做出PTR诊断。1.若输注后1小时CCI〈7500/μL12小时CCI〈6000/μL24小时CCI〈4500/μL连续3次，可判断为血小板无效输注2.血小板恢复（回收率）百分率（PR%）若输注血小板24小时后，PR%〈20%，可判断为血小板无效输注由HLA抗体引起PTR约占80%，其次为HPA或ABO抗体。现由于临床广泛输注去白细胞的成分血治疗血液病，发病率已经大为下降20血小板相关疾病-血小板输注无效(PTR）非免疫学原因(67.3%)发热脾功能亢进感染药物作用DIC血小板的质量问题免疫学原因(17.5%)HLA抗体HPA抗体ABO血型不合血小板自身抗体药物预防1.白细胞过滤2.辐照3.HLA和HPA配型输注21血小板相关疾病-血小板输注无效(PTR）Platelettransfusionrefractoriness,PTR:患者接受充足治疗剂量（≥2.5x1011个/次）的血小板输注后，血液循环中血小板计数未见有效提高，临床出血表现未见明显改善，处于血小板治疗不应状态。一般临床上认为至少有2次及以上输注血小板效果不佳才能做出PTR诊断。1.若输注后1小时CCI〈7500/μL12小时CCI〈6000/μL24小时CCI〈4500/μL连续3次，可判断为血小板无效输注2.血小板恢复（回收率）百分率（PR%）若输注血小板24小时后，PR%〈20%，可判断为血小板无效输注由HLA抗体引起PTR约占80%，其次为HPA或ABO抗体。现由于临床广泛输注去白细胞的成分血治疗血液病，发病率已经大为下降22血小板相关疾病-输血后紫癜输血后血小板减少性紫癜(post-transfusionthrombocytopenicpurpura，PTTP)，又称“输血后紫癜”,Post-transfusionpurpura,PTP:由于血小板输注后发生同种免疫反应所致，一般发病率低。患者被输入不相容的血小板/全血或多次妊娠而产生血小板抗体，破坏输入的和自身血小板而导致急性和暂时性血小板减少。患者多见于（95%)有多次妊娠或输血史的老年女性。23血小板相关疾病-输血后紫癜HPA-1a是引起该病的主要抗原。我国绝大部分人为HPA-1a抗原阳性。实验室检查：血小板计数降低、骨髓巨核细胞增生活跃、血清学检查血小板抗体存在但效价和病情无关。本病输血小板无效，甚至有加重病情的危险，肾上腺皮质激素不能缩短病程，但是，有可能改善出血症状。主要治疗措施为血浆置换或换血，换血浆优于换全血。在输血后血小板显著减少和发生严重出血症状时，应立刻做血浆置换，一次交换65%～85%的血浆量，平均在1～5天后出血症状减退，血小板数目上升。尽可能避免或减少输注血小板及含血小板的血液制品。24血小板相关疾病-新生儿同种免疫血小板减少症(FMAIT/NAIT)胎儿血小板↓怀孕或生产时进入母体循环↓胎儿血小板刺激母体产生抗体↓母亲IgG抗体通过胎盘进入胎儿体内使胎儿血小板致敏↓血小板破坏增加↓发生FAIT25血小板相关疾病-新生儿同种免疫血小板减少症(FMAIT/NAIT)第一胎即可发病；病死率约13%；治疗：输入相合的血小板以提高患儿的血小板数，如找不到相合的血小板，可以输注经洗涤和辐射的母亲血小板，也可给患儿做放血治疗；治疗前交叉配血：以母亲血清与供者血小板进行交叉配合试验；预防：母亲在孕期可进行血浆置换26被动免疫血小板减少症及移植相关的同种免疫血小板减少症Passivealloimmunethrombocytopenia,PAT:患者输入含有血小板特异性抗体的血浆，在数个小时之内出现血小板减少症，约一周后缓解。一旦发现献血员血浆、血清中含有血小板特异性抗体应立即停止献血，这类献血员多为有妊娠史。Transplantation-associatedalloimmunethrombocytopenia,TAT:器官接受者的淋巴细胞产生抗外来移植物（血小板）的特异性抗体；或供体器官中残留的淋巴细胞产生抗宿主血小板的抗体27特发性血小板减少性紫癜（Idiopathicthrombocytopeniapurpura,ITP）ITP[发病机制]一、抗血小板抗体约75%ITP患者可测到血小板相关自身抗体（PAIg），后者多为IgG、IgA也可是IgM。抗体通过Fab片段与血小板膜糖蛋白（GpⅡb/Ⅲa等）结合。带有抗体的血小板接触到单核-巨噬细胞表面的FC受体，易被吞噬破坏。另外，抗血小板抗体对巨核细胞分化也有抑制作用。二、血小板生成时间缩短ITP血小板生存可缩短至2~3天或更短，ITP患者血小板易在脾脏被扣留。脾脏可产生抗血小板抗体，脾内的巨噬细胞参与破坏血小板过程，切脾对相当部分的患者有效。28特发性血小板减少性紫癜（Idiopathicthrombocytopeniapurpura,ITP）ITP急性型：儿童多见，初起有上感，主要为病毒细菌所致。可有寒热，全身皮肤粘膜出血(瘢点，紫癜或血肿)、内脏出血。﹤1%患者颅内出血，危及生命，但大多数呈自限性，一般4~6周可自行缓解。慢性型：主要见于40岁以下女青年，症状多在偶然中发现，也有皮肤粘膜的出血，内脏出血较少见，月经过多者可引起贫血。29特发性血小板减少性紫癜（Idiopathicthrombocytopeniapurpura,ITP）I