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核技术：能量的放大计算机芯片：信息的集成20世纪自然科学的两大成就PCR技术：生命信息的放大基因芯片：生命信息的集成20世纪生命科学的两大成就PCR技术高考专题复习目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序的步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞一、目的基因的获取1、目的基因概念：主要指的是编码蛋白质的结构基因。也可以是一些具有调控作用的因子。2、目的基因获取方法：从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因化学方法直接人工合成从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）基因文库的构建过程基因组文库限制酶供体细胞的全部DNA大量DNA片段拼接到载体上导入受体细胞扩增基因文库的构建过程mRNA单链DNA双链DNA逆转录cDNA文库利用PCR技术扩增目的基因PCR的全称：聚合酶链式反应PCR的原理：DNA复制PCR技术扩增目的基因的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。模板原料引物酶控制温度利用PCR技术扩增目的基因——目的基因DNA——四种脱氧核苷酸——如单链DNA分子片段——耐热的DNA聚合酶——PCR仪自动调控PCR的条件：多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction），是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。1988年美国穆里斯（K.Mullis）等人发明，荣获1993年诺贝尔化学奖。PCR【基础知识】一、PCR原理：DNA复制：半保留复制；DNA的热变性原理。TaqDNA聚合酶耐高温。【基础知识】一、PCR原理：DNA复制：半保留复制；需要提供合成模板；不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3’-OH；合成的方向都是5’→3’。DNA聚合酶【基础知识】二、PCR条件：胞内DNA复制与PCR技术的比较：胞内DNA复制PCR解旋解旋酶，边解旋边复制酶解旋酶/DNA聚合酶模板DNA母链引物RNA能量+原料dNTP温度最适温度缓冲液Mg2+,缓冲对子链合成半不连续复制变性TaqDNA聚合酶DNA母链dNTP3个温度Mg2+,缓冲对连续复制DNA【基础知识】二、PCR条件：引物：引物设计的原则：决定PCR扩增产物的特异性和长度。1.引物长度：通常为20～30bp，尽量降低引物与非扩增区的同源性；2.引物内部不能存在部分互补序列；3.两个引物之间不能存在部分互补序列；例题1【2011年安徽】家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、和。对干扰素基因特异的DNA引物对TaqDNA聚合酶例题2【2011年江苏】请回答基因工程方面的有关问题：（1）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。①第一组：；②第二组：。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效（2）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为。DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上【基础知识】二、PCR条件：温度：70℃～75℃：90℃～95℃：55℃～60℃：变性；复性；延伸。【注意】具体温度与DNA母链及引物中的G、C含量有关。例题3【2008年江苏】回答下列问题。（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？。耐高温引物对B【基础知识】三、PCR过程：预变性；复性；延伸；循环。变性；【2011年江苏】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。（1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为。（2）在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。15/16三例题4【2011年北京】根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。如下图，从图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因的全序列信息。B、C例题5【实验操作】一、实验仪器：二、设置对照：【实验操作】三、程序设计：避免外源DNA的污染。【实验操作】微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；微量离心管在每吸取一种试剂都必须更换枪头；所有的成分加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，离心10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。四、操作提示：【实际应用】一、遗传疾病的诊断：二、刑侦破案；三、古生物学；四、基因克隆：五、DNA序列测定。基因诊断；