多聚酶链式反应-极好!

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。多聚酶链式反应DNA遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆DNA序列测定。2、PCR技术的应用一、基础知识（一）回忆DNA的复制回答相关问题1、发生时间：发生在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期。2、特点(方式)：边解旋边复制半保留复制多起点复制3、合成条件模板：原料：游离的脱氧核苷酸DNA两条链能量：ATP酶:解旋酶、DNA聚合酶反应条件温和4、场所：细胞核(主)、线粒体、叶绿体DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（二）DNA复制的条件12345脱氧核苷酸结构1．DNA的平面结构：OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’磷酸二酯键DNA3’端，5’端指什么。DNA的羟基(-OH)末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。脱氧核苷酸链结构目录上页下页习题参考书返回ATGCATGC5，端含磷酸基团3，端含羟基3，端5，端目录上页下页习题参考书返回DNA聚合酶的特性---专一性DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。观察图2复制的方向：2方向：子链的5’端向3’端延伸。（1）、DNA分子的热变性原理DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：解开双链:解开氢键在80~100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为2、PCR原理变性高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。（2）、TaqDNA聚合酶的应用（3）、PCR反应的条件①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）；③四种脱氧核苷酸；④耐高温的聚合酶（TaqDNA聚合酶）；⑤控制温度，但不需解旋酶；⑥需要在一定的缓冲液中进行。PCR反应需要的这些条件的原因是什么？1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1~3步30轮（1）、步骤：变性——复性——延伸二、PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA5555555525～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。2、PCR的反应结果①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。三、PCR反应的实验操作1、PCR仪设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上一台能够自动调控温度的仪器三、PCR反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：（6）、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头四、结果分析与评价DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算（DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数）波长260nm处读数蒸馏水做对照50倍（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关五、课题延伸例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异性强、敏感性高、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点。体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向子链的5’端向3’端延伸子链的5’端向3’端延伸