第七章-微生物的生长与环境条件

第七章微生物的生长与环境条件通过本章的学习，要求掌握：1、微生物生长量的测定方式。2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点。3、物理因子，化学药物对微生物生长的影响。重点：细菌纯培养生长曲线。难点：如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来计算细菌的代时和代数。微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单地说，生长growth就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形式两个基本相的子细胞。这种由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖reproduction。在多细胞微生物中，如某些霉菌，细胞数目的增加（菌丝细胞的不断延长或分裂）如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长。只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育development。如果某一或某些环境条件发生改变，并超出了生物可以适应的范围时，就会对机体产生抑制乃至杀灭作用。第一节纯培养微生物群体的生长微生物在自然界总是混杂地生活在一起，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养pureculture。一、纯培养技术获得纯培养的方法稀释倒平板法pourplatemethod涂布平板法spreadplatemethod平板划线分离法streakplatemethod平行划线扇形划线其他形式的连续划线稀释摇管法dilutionshakeculturemethod利用选择培养基分离法根据所要分离的菌种的特性选用培养基，如：①分离真菌用马丁氏培养基，pH偏酸；分离放线菌用高氏1号，pH中性偏碱。②不同菌对化学试剂的敏感性：分离放线菌，培养基中加10%酚，抑制细菌、真菌；从土壤中分离真菌，加孟加拉红，抑制细菌生长。③根据分离对象的营养特征：分离能发酵纤维素的菌株，培养基以纤维素为唯一碳源。分离固氮菌，用无氮培养基。二、微生物生长量的测定测定单细胞微生物的数量测定总菌数totalcount计数板直接测数比浊法测定微生物的活菌数viablecount稀释平板测数法diluteplatecount以CFU(colonyformingunits)表示•稀释培养测数法（又称最大概率法，MPNmostprobablenumber）细胞生物量测定①细胞干重测定：单位体积的培养液中的微生物细胞的干重。②总氮量测定法：用化学分析方法测出微生物细胞中蛋白质或氮元素的含量。③DNA含量测定法：用荧光法测定微生物细胞中DNA含量。④代谢活性法：根据微生物生命活动的强度来估算生物量。如单位体积培养物在单位时间内的O2消耗、糖消耗或产酸产CO2量等，它们在一定程度上间接地反映细胞生物量。三、细菌纯培养的生长以少量纯培养细菌接种一定容积的培养基中经过培养生长，最后一次收获，此称分批培养(batchculture)。衰亡期稳定期对数期滞留期①延滞期lagphase（滞留适应期）菌种初接入新鲜培养液内，微生物细胞需要通过自身生理机能的调节逐步适应新环境。表现为细胞数量不增加了但细胞个体体积增大，代谢活跃。②对数期logarithmicgrowthphase细菌在这个时期生长旺盛，代谢活力强。分裂速度快，菌数以指数级数增加，代时稳定。细胞在形态、生理等方面较为一致，是研究微生物生理代谢和遗传变异的好材料。在工业生产中，也用对数期细胞作为扩大培养的种子液。在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的，即20→21→22→23……2n这里的指数n为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌繁殖n代产生2n个细菌。如果在对数期开始时间t1的菌数为x1，繁殖n代后到对数期后期t2的菌数为x2，则代时（Generationtime，G）（即每增加一代所需要的时间）应为：G=（t2-t1）/n先求代数n由于x2=x1·2nlgx2=lgx1+nlg2；n=（lgx2-lgx1）/lg2n=3.3·lg(x2/x1)即G=（t2-t1）/3.3·lg(x2/x1)例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为104/ml，经过培养4h后，又测得菌液中的细菌数为108/ml，求此菌的世代时间和在此时间内繁殖的代数。根据公式：G=（t2-t1）/3.3·lg(x2/x1)t2-t1=（4-0）×60min=240minx2=108x1=104lg(x2/x1)=lg108~lg104=8-4=4代入上式G=240/3.3×4=240/13.2=18min即在上述培养液中，世代时间为18min。细菌繁殖代数n=(t2-t1)/G=240/18=13.3繁代。③稳定期(stationaryphase)又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生长呢?这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高；这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。从上可以看出，稳定期的微生物，在数量上的达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，此时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系，这种关系，生产上称为产量常数。④衰亡期(declinephase)细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”。其中有一段时间，活菌数换几何级数下降，故有人称之为“对数死亡阶段”。这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。并不是所有细胞均处于完全相同的生理状态，因此，在细菌生长的整个周期，细菌数和培养时间，往往是一条缓慢上升以后又逐渐下降的曲线。认识和掌握细菌生长曲线，对指导发酵生产具有很大作用：计算生长速率和代时；不同生长期的细胞在结构和生理上可能有很大差别，了解了这些，就能根据需要进取样和收获；不同的生长期理化因子对微生物的影响了可能不同。一般来说，对数生长期的细胞较为一致，因此常用于研究细胞的新陈代谢。四、连续生长当微生物在一个固定的容器中生长时，由于养料的消耗，代谢产物的积累，必然会导致微生物生长速度减慢，为了保持微生物能长时期的处于对数生长期，就要采用连续培养continuousculture，即在一个恒定容积的流动系统中，一方面以一定的速度不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速度流出培养物，这样就可以使容器中微生物的数量和营养状态保持恒定，使微生物长期处于旺盛生长阶段。恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养物浊度保持恒定的连续培养叫恒浊连续培养。由光电装置检测培养容器中的浊度，根据浊度变化控制新鲜培养液流入和旧培养流出速度，使容器内菌液浓度恒定。工业发酵中用此法可获得大量菌体及代谢产物。恒化培养控制恒定流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，又叫恒组成连续培养。这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。恒化连续培养多用于微生物学的研究工作中。从遗传学角度来讲，它允许我们作长时间的细菌培养而能从中分离不出的变种；从生理学方面看，能帮助我们观察细菌在不同生活条件下的变化，尤其是DNA、RNA及蛋白质合成的变化；同时它也是研究自然条件下微生物生态体系比较理想的实验模型，因为，生长在自然界的微生物一般都处于低营养浓度条件下，生长也较慢。而恒定连续培养正好可通过调节控制系统来维持培养基成分的低营养养浓度，使之与自然条件相类似。五、同步培养在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不完全一样。如果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长或生理特性是不符合客观实际的，然而利用单个细胞进行研究又是很困难的。为了解决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。同步培养法是：能使培养的微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养方法叫同步培养法synchronousculture。机械法又称选择法微生物的子细胞与成熟细胞，通过机械法就可使它们在一定程度上分开来。然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。离心沉降分离法过滤分离法硝酸纤维薄膜法机械法同步培养物是在不影响细菌代谢的情况下获得的，因而菌体的生命活必然较为正常。但此法有其局限性，有些微生物即使在相同的发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，这样的微生物不宜采用这类方法。调整生理条件的同步法（诱导法）温度调整法将微生物的培养温度控制在亚适温度条件下一段时间，使细胞的生长在分裂前不久的阶段稍微受到抑制，然后将培养温度提高或降低到最适生长温度，大多数细胞就会进行同步分裂。营养条件调整法即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限制碳源或其他营养物，使细胞只能一次分裂而不能继续生长，从而获得了刚分裂的细胞群体，然后再转入适宜的培养基中，它们例进入了同步生长。用最高稳定期的培养物接种抑制DNA合成法利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除其抑制，也可达到同步化的目的。试验证明：氨甲蝶呤、5-氟脱氧尿苷、羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷等，对细胞DNA合成的同步化均有作用。总之，机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱导同步分裂虽然方法多，应用较广，但对正常代谢有时有影响，而且对其诱导同步化的生化基础了解很少，化学诱导同步化的本质还是一个尚待研究的问题。必须根据待试微生物的形态、生理性状来选择适当的方法。同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2~3个世代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化。第二节真菌的生长一、菌丝的生长繁殖菌丝生长与营养有关。营养丰富，分支多而密，营养贫乏，分支少而稀。菌丝的生长是顶端生长，菌丝各个部分都有极性之分，即位于前端的为幼龄菌丝，位于后面的为老龄菌丝。菌丝生长与营养有关，营养丰富则分支点与菌丝生长顶端的距离短，即分支多而频繁；营养贫乏分支点同菌丝生长顶端距离长，即分支少。菌丝在固体培养基或在液体培养中静止培养时形成菌落，在液体培养中振荡培养时则形成菌丝球。二、孢子生长无性孢子繁殖孢子的生长包括:孢子肿胀（外源肿胀，不需营养；内源肿胀，需要营养）;萌发管形成;菌丝生长。有性孢子繁殖第一阶段是质配（plasmogamy）第二阶段为核配（karyogamy）第三阶段是减数分裂（meiosis）第三节环境条件对微生物生长的影响生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的改变，在一定限度内，可能上能引起微生物形态，生理、生长、繁殖等特征的改变，或者抵抗、适应环境条件的某些改变；当环境条件的变化超过一定极限，则导致微生物的死亡。研究环境条件与微生物之间的相互关系意义重大。本节将较多地涉及各种物理、化学因素对微生物生长的抑制与致死的影响。防腐antisepsis它是一种抑菌作用。利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的状态。这是一种防止食品腐败和其他物质霉变的技术措施。如低温、干燥、盐腌、糖渍等等。消毒disinfection是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。例如将物体煮沸10min，就可杀死病原菌的营养