分子克隆方法之同源克隆方法(20160115)

第一部分---从头合成质粒单片段克隆多片段克隆第二部分---已有质粒改造突变缺失插入分子克隆之同源克隆方法从头合成质粒之单片段克隆用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段从cDNA做PCR获取包含目的基因CDS序列的片段含目的基因片段的质粒单片段克隆流程图目的质粒同源反应PCR产物纯化目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化+转化AAA…5’3’5’3’3’5’cDNA质粒5’3’3’5’正向引物(实线)反向引物(实线)目的基因片段PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段PCR获取包含目的基因CDS序列的片段目的基因片段质粒同源序列（15-20bp）质粒同源序列CDS区域单片段克隆原理图一与基因互补序列（18-27bp）5’3’3’5’3’5’5’3’线性化载体目的质粒同源反应示意图3’---5’外切酶活性PCR产物纯化目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化+单片段克隆原理图二PrimeSTARMaxPremix（2×）25μLPrimer11μLPrimer21μLddH2O22.5μLTemplate0.5μLTotal50μLPCR反应体系(TakaraPrimeSTAR)PCR仪设置*建议模版量小于10ng(尤其是模板为含目的基因片段的质粒)*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化PCR反应体系(以TakaraPrimeSTAR为例)98℃10s55℃5s30-35Cycles72℃30s/kb72℃30s/kb12℃+∞ddH2OUpto10μl5×CEIIBuffer2μl线性化克隆载体25～100ng插入片段扩增产物10～100ngExnase®II1μlTotal10μl5×CEIIBuffer2μl线性化克隆载体1μl插入片段扩增产物6μlExnase®II1μlTotal10μl同源反应体系(标准版)同源反应体系(简便版)同源反应体系（Vazyme产品）*同源反应37℃30min，后置于冰上5min*同源反应产物全部用于转化100μL感受态细菌(慢病毒载体需要用Stbl3感受态)*同源反应产物可保存于-20℃*已线性化质粒：pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neoPCDNA3.1+pcDNA6myc-His_ApDsRed-Monomer-C1pEGFP-N1pGEX-6P-1…从头合成质粒之多片段克隆用包含同源序列的引物做PCR扩增出含同源序列的片段1从cDNAPCR获取包含目的片段1含目的片段1的质粒目的质粒同源反应片段1PCR产物纯化目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化片段2PCR产物纯化片段3PCR产物纯化+++…+转化多片段克隆流程图3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’线性化载体目的质粒多个片段PCR及其产物纯化目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化+引物设计同源反应多片段克隆原理图（方法一）---更适用于单个位置突变数较多突变位点设计在同源序列内5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’线性化载体目的质粒多个片段PCR及其产物纯化目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化引物设计同源反应+多片段克隆原理图（方法二）---适用于仅多片段融合或单个位置仅一个点突变突变位点设计在同源序列内PrimeSTARMaxPremix（2×）25μLPrimer11μLPrimer21μLddH2O22.5μLTemplate0.5μLTotal50μLPCR反应体系(TakaraPrimeSTAR)PCR仪设置*建议模版量小于10ng(尤其是模板为含目的基因片段的质粒)*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化PCR反应体系(以TakaraPrimeSTAR为例)98℃10s55℃5s30-35Cycles72℃30s/kb72℃30s/kb12℃+∞同源反应体系(标准版)同源反应体系（Vazyme产品）*同源反应37℃30min，后置于冰上5min*同源反应产物全部用于转化100μL感受态细菌(慢病毒载体需要用Stbl3感受态)*同源反应产物可保存于-20℃*已线性化质粒：pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neoPCDNA3.1+pcDNA6myc-His_ApDsRed-Monomer-C1pEGFP-N1pGEX-6P-1…多片段克隆同源反应体系（标准版）ddH2OUpto10μl5×CEMultiSBuffer2μl线性化克隆载体[0.01×片段碱基对数]ng(0.15pmol)插入片段扩增产物1[0.01×片段碱基对数]ng(0.15pmol)插入片段扩增产物2[0.01×片段碱基对数]ng(0.15pmol)插入片段扩增产物3[0.01×片段碱基对数]ng(0.15pmol)……Exnase®MultiS1μlTotal10μl已有质粒改造之突变以质粒为模版用包含同源序列的引物做PCR，扩增得到线性质粒目的质粒同源反应PCR产物纯化转化质粒突变流程图质粒突变原理图一第一轮PCR示意图第二轮PCR示意图第二轮PCR线性化示意图引物（实线）需突变区域（渐变色）质粒突变原理图二第三轮及之后PCR示意图同源反应示意图目的质粒第三轮及之后PCR线性化示意图PrimeSTARMaxPremix（2×）25μLPrimer11μLPrimer21μLddH2O22.5μLTemplate0.5μLTotal50μLPCR反应体系(TakaraPrimeSTAR)PCR仪设置*建议模版量小于10ng*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化*扩增效率不佳时，可延长至≤35CyclesPCR反应体系(以TakaraPrimeSTAR为例)98℃10s55℃5s≤30Cycles72℃30s/kb72℃30s/kb12℃+∞同源反应体系(标准版)同源反应体系(简便版)同源反应体系（Vazyme产品）5×CEIIBuffer2μlPCR所得线性化质粒7μlExnase®II1μlTotal10μlddH2OUpto10μl5×CEIIBuffer2μlPCR所得线性化质粒25～200ngExnase®II1μlTotal10μl*同源反应37℃30min，后置于冰上5min*同源反应产物全部用于转化100μL感受态细菌(慢病毒载体需要用Stbl3感受态)*同源反应产物可保存于-20℃已有质粒改造之缺失片段以质粒为模版用包含同源序列的引物做PCR，扩增得到线性质粒目的质粒同源反应PCR产物纯化转化质粒片段缺失流程图质粒片段缺失原理图一第一轮PCR示意图第二轮PCR示意图第二轮PCR线性化示意图引物（实线）需缺失区域（紫色）质粒片段缺失原理图二第三轮及之后PCR示意图同源反应示意图目的质粒第三轮及之后PCR线性化示意图PrimeSTARMaxPremix（2×）25μLPrimer11μLPrimer21μLddH2O22.5μLTemplate0.5μLTotal50μLPCR反应体系(TakaraPrimeSTAR)*建议模版量小于10ngPCR反应体系(以TakaraPrimeSTAR为例)PCR仪设置*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化*扩增效率不佳时，可延长至≤35Cycles98℃10s55℃5s≤30Cycles72℃30s/kb72℃30s/kb12℃+∞同源反应体系(标准版)同源反应体系(简便版)同源反应体系（Vazyme产品）5×CEIIBuffer2μlPCR所得线性化质粒7μlExnase®II1μlTotal10μlddH2OUpto10μl5×CEIIBuffer2μlPCR所得线性化质粒25～200ngExnase®II1μlTotal10μl*同源反应37℃30min，后置于冰上5min*同源反应产物全部用于转化100μL感受态细菌(慢病毒载体需要用Stbl3感受态)*同源反应产物可保存于-20℃已有质粒改造之插入片段以质粒为模版用包含同源序列的引物做PCR，扩增得到线性质粒目的质粒同源反应PCR产物纯化转化质粒插入片段流程图质粒插入片段原理图一第一轮PCR示意图第二轮PCR示意图第二轮PCR线性化示意图引物（实线）需插入区域（渐变色）质粒插入片段原理图二第三轮及之后PCR示意图同源反应示意图目的质粒第三轮及之后PCR线性化示意图PrimeSTARMaxPremix（2×）25μLPrimer11μLPrimer21μLddH2O22.5μLTemplate0.5μLTotal50μLPCR反应体系(TakaraPrimeSTAR)*建议模版量小于10ngPCR反应体系(以TakaraPrimeSTAR为例)PCR仪设置*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化*扩增效率不佳时，可延长至≤35Cycles98℃10s55℃5s≤30Cycles72℃30s/kb72℃30s/kb12℃+∞同源反应体系(标准版)同源反应体系(简便版)同源反应体系（Vazyme产品）5×CEIIBuffer2μlPCR所得线性化质粒7μlExnase®II1μlTotal10μlddH2OUpto10μl5×CEIIBuffer2μlPCR所得线性化质粒25～200ngExnase®II1μlTotal10μl*同源反应37℃30min，后置于冰上5min*同源反应产物全部用于转化100μL感受态细菌(慢病毒载体需要用Stbl3感受态)*同源反应产物可保存于-20℃附：其他引物设计方法质粒PCR原理图(不推荐)引物背靠背设计，无互补区域引物完全互补反向引物部分互补相向