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聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳PCR-DGGE（PolymeraseChainReaction-DenaturingGradientGelElectrophoresis)汇报人：学号：环境微生物新技术目录（一）DGGE的简介（二）DGGE的定义（三）DGGE的基本原理（四）PCR-DGGE的操作流程（五）DGGE的优缺点（六）DGGE的应用变性梯度凝胶电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE)最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标记方法。使用对象：长度相同但序列不同的DNA片段变性剂：尿素和甲酰胺DGGE不是将分子量不同的DNA分开,而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。原理：根据DNA的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值取决于DNA分子中G-C含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60℃，变性剂0~100%。DGGE的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使实验无法检出存在于高TmDNA片段中的碱基替换。为了解决此问题。可以在一个PCR引物的5'端设计一段富含G-C的尾巴，从而使扩增产物富含G-C碱基对（30~40bp),保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE的突变检出率接近100%。根据变性剂梯度方向的不同,DGGE可分为:垂直DGGE和平行DGGE（1）垂直DGGE，变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;（2）平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测DGGE的分类环境样品基因组DNA的提取目标片段的PCR扩增DGGE图谱的分析图像的采集和条带的回收DGGE分析电泳前准备工作电泳分析剥胶、染色DGGE条带测序总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合的DNA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要。适合DNA提取方法的考量：①DNA的得率②能否进行PCR扩增以及扩增的重复性③制备DNA花费时间的长短。关于DNA提取的建议：优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用酶解/酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购买Qiagen公司相关产品）。•选择适合的目标片段，设计合适的引物，注意有GC夹子情况下引物二聚体的行程。•环境样品目标片段的扩增最好采用TouchdownPCR。•注意PCR的环境，V3区产物扩增极易污染。DGGE的操作流程主要有：制胶点样电泳显色成像分析（1）DGGE前的准备工作从这一步开始，带上手套。1.配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。2.制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。3.灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物品摆放的位置。4.制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。5.灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。（2）电泳上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。上样时上样器要深入胶孔底部。尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有markerlane。将胶放入电泳槽中时注意正负极。建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。3DGGE分析（3）剥胶与染色•停止电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源•剥胶需要细致，用好去离子水和保鲜膜。•染色前做好胶样品顺序的标记。•通过各种染色方法可以看到DGGE胶中的DNA条带。一般有银染、EB染色和SYBRGreen染色。EB法染色的灵敏度最低。SYBRGreenI和SYBRGold相比EB，能更好地消除染色背景，此它们的检测灵敏度比EB法高很多。EB和SYBR染色时，双链DNA能很好地显色，单链DNA基本上不能显色。银染法的灵敏度最高，它不但能染双链DNA，也能染单链DNA，它的缺点是不能用于随后的杂交分析。获得高质量的DGGE图谱。DGGE条带的回收－－注意紫外条件下操作的安全。－－尽量减少DNA在紫外下的照射时间。－－不同长度目标片段从切胶条带中的回收。测序注意要点－－回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆－－确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送去测序－－每个条带至少测3个克隆DGGE图谱的聚类分析、相似性分析：DGGE胶通过扫描仪输入计算机,通过MolecularAnalysis软件进行相似性分析。通过DGGE后得到的指纹图谱,每一个条带代表某个微生物优势菌群,通过测序和序列比对,可以得出此优势菌群的种类。DGGE图谱的主成分分析DGGE图谱的数字化——Quantityone多样性指数的计算用QuantityOne（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱进行数字化处理。按照如下公式计算多样性指数（Shannon-Wienerindex）其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰度（heightofthepeak）占该泳道总灰度的比例。菌群均匀度（evenness，E）：E=H′/H′max，H′max=lnS优点（1）DGGE的最大优点就是无需进行微生物培养，且能检测出难以或不能培养的微生物，同时检测多种微生物（2）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上几乎可以检出所有突变（3）可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析（4）无须标记。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（5)操作简便、快速、重复性好、结果准确可靠。电泳前只需一步操作，DGGE一般在24小时内即可获得结果。PCR-DGGE方法则能客观完整地鉴定微生物，根据参考菌株和样品16SrRNA的PCR产物在凝胶中的相对位置来进行判断．若割胶测序，然后序列比对，就可以得出遗传相关性（6)可用于未经扩增的基因组DNA,可检测出象甲基化这样的DNA修饰缺点(1)只能分离较小的片段(500bp),对于大片段的分离效率下降(2)DGGE图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株,或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成(3)DGGE通常显示群落中优势种类的rDNA片段,只有占整个群落细菌数量约l%或以上的类群能够通过DGGE检测到。(4)由于某些种类的16SrDNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。(5)DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。(6)需要专门设备，用计算机对序列进行分析，(7)需要进行预实验昂贵的“GC夹板”用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶(8)无法确定突变在DNA片段中位置注意事项1．配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。2．制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。3．灌完胶后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。4．DGGE的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。5．点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。6．银染的整个过程中，一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的污染。7．每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。谢谢！