结核病的实验室诊断

结核病的实验室诊断主要内容结核病的流行情况1结核病的病原学32结核病的实验室诊断3结核病的分子药敏341.结核病的流行概况全球范围内结核病疫情急剧恶化•人口大规模流动•结核菌耐药现象益发严重•结核病合并艾滋病感染我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国•结核菌感染率44.5%•新发活动性结核患者130万/年•死亡13万/年2011WHOtuberculosiscontrolreport我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一2013年世界卫生组织宣布全球耐多药结核病紧急状态全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！！！早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键：有细菌学诊断依据的病人不超过50%当前结核研究的热点•新型抗结核药物(50%)•新型快速诊断技术(40%)•新型结核疫苗(10%)7/45近期结核病诊断方法的相关研究JID2012:205(Suppl2),S147.2.结核病的病原学结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引起人类结核病的主要病原体。1882年由德国医生Koch发现。结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。2020/4/24GDTB8结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性生长特点：生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要15～20小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要15～20小时，在家兔角膜中约需要20～22小时。实验室检查方法的历史1880sTuberclebacilli的发现Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantouxtest(TSTwithtuberculin)1920sPetragnanimediumPurifiedProteinDerivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen培养基1940sDubosagar,Ogawa培养基1950sMiddlebrook7H91990sNAAT2000sELISPOT,QuantiFERON,2010sLPA,GeneXpert2020s???3.结核病的实验室诊断细菌学涂片：敏感性低传统固体培养：所需时间长，2~3月分子生物学TB-DNATB-mRNA血清/免疫学IGRA：有望替代TST，但不能区分活动性TB与潜伏感染血清学：存在抗原纯度和特异性差等方面的问题液体培养及药敏试验：平均时间20天①.细菌学诊断萋尼氏染色荧光染色罗氏培养/药敏试验我国目前最常用的结核病实验室诊断技术快培/药敏试验涂片►干燥►固定初染脱色复染显微镜检查登记/报告显微镜检查碱性复红盐酸酒精亚甲兰石炭酸金胺O盐酸酒精高锰酸钾光学显微镜检查荧光显微镜检查萋尼氏染色镜下形态荧光染色镜下形态LEDFluorescencemicroscopyLED荧光显微镜LED荧光显微镜•成本低廉的超亮发光二极管•可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜•寿命长（~15-20,000小时）•省电•可用电池供能•可靠性更强•不需要空调设施•不需要暗室•诊断性能优于标准荧光显微镜•操作人员工作负荷减轻普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结果进行汇总与平均）显微镜方法灵敏度(%)特异度(%)普通荧光显微镜直接涂片67.496.1普通荧光显微镜浓集涂片66.699.2发光二极管荧光显微镜直接涂片71.6(p=0.1025)96.4发光二极管荧光显微镜浓集涂片72.4(p=0.0073)98.8Bactec®MGIT960/320Bact/Alert3DVERSATREK生产厂家美国BD公司法国生物梅里埃公司美国Trek诊断公司仪器定位专业分枝杆菌检测系统业内金标准普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件单机容量960个检测位每年可至少检测8000个样本240个瓶位每年可检测2000个样本528个瓶位日均标本处理量25~30个6~7个9个检测原理荧光增强法：采用敏感性较强的荧光信号探测氧气的变化情况，只需单一反应，所以速度快，准确性高PH值比色法：当培养瓶内有微生物生长，其释放出的CO2，经水饱和后，产生H+，使PH值产生变化，感应器的颜色也随之变化。需双重反应，因此速度较慢，假阳性率较高，此技术已趋向淘汰压力检测：检测细菌生长中各种气体产生和消耗而引起的瓶内压力的变化。灵敏度差。此技术已趋向淘汰检测技术瓶外检测技术瓶外检测技术瓶内检测技术易导致污染及生物安全问题平均阳性报告时间8－11天15－21天不详药敏试剂5种一线抗TB药物，全部具有FDA及SFDA认证无药敏试剂提供只有3种一线药物培养/药敏试验阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光传感器对氧气高度敏感的钌复合物肉汤改良Middlebrook7H9肉汤上部空间已预先充填10%CO2BACTEC™MGIT™960/320指示器系统MGIT/3D制造的液体培养基优点•比固体培养快(平均10-12天vs.20-24天)•比固体培养基更敏感•可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读•也加快了药敏试验的速度局限•需要NALC-NaOH进行痰处理和离心•普通菌群的污染很常见•比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病）•确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的鉴定•比固体培养基昂贵②血清学诊断血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法(WesternBlotting)等等WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%~60%，特异度为53~99%1。原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。WHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHOWorldHealthOrganization.DiagnosisevaluationseriesNo.2:laboratory-basedevalutionof19commerciallyavailablerapiddiagnostictestsfortuberculosis.2008.WHO对结核抗体评估2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis.不能早期诊断！容易漏诊、误诊！血清学检测的评价•结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。•由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。•基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。•目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英国OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子诊断:γ-干扰素释放实验（IGRA)γ-干扰素释放实验（IGRA）γ干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素T-SPOT®.TB原理T-SPOT®.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：•早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）•培养滤液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）结核杆菌特异抗原•由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白•所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列•绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区ESAT-6与CFP-10抗原结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲T-SPOT®.TB临床性能指标•特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)•灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)灵敏度ReferenceSensitivityJafarietal2006AJRCCM174;9:1048-53100.0%(12/12)FerraraetalLancet2006376;1328-34*83.3%(20/24)LeeetalEurRespirJ200628;24-30*96.6%(84/87)GolettietalClinMicrobiolInfect200612;6:544-50*91.3%(21/23)MeieretalEJCMID200524;529-53695.9%(70/73)KangetalChest.2007Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)JanssensetalERJ200730(4):722-898.3%(57/58)ClarkeetalClinExpImmunol2007150(2):238-44.90.0%(27/30)DetjenetalCID20071;45(3):322-8*92.9%(26/28)OzekincietalJIntMedRes2007;35:696-70392.9%(26/28)SoysaletalIJTLD200812(1):50-56*80.8%(80/99)DominguezetalClinVaccImmunol200815(1);168-71*85.7%(36/42)CheeetalJClinMicrobiol.2008Apr9*94.1%(254/270)VincentietalClinExpImmunol.2007Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)WangetalEmergingInfectDis200713;4:553-887.2%(34/39)LosietalEurRespirJ.2007Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)KimetalArchInternMed167;20:2255-2259100.0%(22/22)ConnelletalPLoSONE2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashietal.ScandJInfectDis2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashietal.JInfect.2008[Epubaheadofprint].*90.0%(36/40)Domínguezetal.DiagnMicrobio