色质联用技术的方法、原理与应用(讲座)

第一节、概述第二节GC-MS联用技术第三节LC-MS联用技术第四节质量分析器的串联与扫描功能第六节应用第五节MSn质谱及用途•色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。•色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。此外还有CE-MS，CEC-MS。第一节、概述一、GC-MS联用仪器主要组成部分第二节GC-MS联用技术1.电子轰击（EI）2、化学电离（CI）（三）质量分析器1、四极杆质量分析器2、离子阱质量分析器3、飞行时间质量分析器（四）检测器离子倍增管（一）接口1.直接导入型2.喷射分离型3.开口分流型（二）离子源二、气质联用仪(GC-MS)提供的谱图三、气质联用仪(GC-MS)的扫描功能四、气-质联用质谱谱库和计算机检索五、应用1.GC-MS(分子分离器-四极杆)联用仪器结构示意图GC-MS联用仪器结构示意图2.GC-MS(分子分离器-TOF)联用仪器结构示意图将色谱与质谱通过一种称为“接口”（Interface）的装置直接联接起来，将通过色谱仪分离后的各种组分，逐一通过接口送入到第二种仪器中进行分析。将两种分析仪器的分析方法在线结合起来。因此，接口是色谱联用技术中的关键装置，它要协调前后两种仪器的输出和输入间的矛盾。要求既不影响前一级色谱仪器对组分的分离性能，又能同时满足后一级仪器对样品进样的要求(分离掉流动相）和仪器的工作条件（真空度）。（一）GC-MS的接口装置接口Y％分离原理适用性直接导入型100无分离小孔径毛细管柱开口分流型~30无分离毛细管柱喷射式分离器①~50喷射分离填充柱／毛细管柱Y＝（qMS／qGC）×100％1、直接导入型适用于内径在0.25至0.32mm，载气流量在0.7～1ml／min的毛细管柱。载气和待测物通过一根金属毛细管直接引入质谱仪的离子源。由于载气氦气是惰性气体不发生电离，被真空泵抽走，而待测物都会形成带电粒子。这种接口方式是迄今为止最常用的一种技术。优点：①死体积小，无分子量的歧视效应②无样品损失，灵敏度高缺点：①不适用于大口径的色谱柱。②固定液的流失，会污染离子源。③载气限于氦气或氢气。2、喷射式分子分离器：工作原理是根据气体在喷射过程中不同质量的分子都以超音速的同样速度运动，不同质量的分子具有不同的动量。动量大的分子，易保持沿喷射方向运动，而动量小的易于偏离喷射方向，被真空泵抽走。分子量较小的载气在喷射过程中偏离接受口，分子量较大的待测物得到浓缩后进入接受口。优点：具有体积小热解和记忆效应较小，待测物在分离器中停留时间短，适用于各种口径的色谱柱等。缺点：不适用于挥发性大的组分3．开口分流型接口（Open-SplitCoupling）不适用于填充柱（二）离子源1.电子轰击（EI）离子源热电子（70eV））轰击分子，使其电离。􀃊丰富的碎片离子==丰富的结构信息““指纹”缺点：①不适用于难挥发、热不稳定的样品。②分子离子不稳定的，易碎裂，不能得到分子量③谱图复杂，解析困难。④只能检测正离子，不能检测负离子。优点：①离子化效率高，灵敏度高。②碎片离子多，结构信息丰富，图谱指纹性强③有庞大的EI标准图谱库可供检索。（1）正化学电离（PCI）离子源2、化学电离（CI）离子源反应气体：甲烷、异丁烷、氨气、胺等。反应气体的浓度是样品气体的1000倍CH4＋e→CH4+·＋2eCH4+·→CH3++H·②初级离子CH4+·和CH3+与CH4分子的反应生成次级离子：CH4+·＋CH4→CH5+＋CH3·CH3+＋CH4→C2H5+＋H2③次级离子CH5+和C2H5+与试样分子（M）的发生离子分子反应，生成准分子离子：由(M十H)或(M-H)离子很容易测得其相对分子质量.①反应气体受到电子轰击生成初级离子：M+CH5+→[MH]++CH4M+C2H5+→[MH]++C2H4M+C2H5+→[MH]++C2H6离子化原理：优点：①图谱中最强峰是准分子离子峰，故易获得物质的分子量。②碎片离子少，图谱简单。缺点：①不适用于难挥发、热不稳定的样品。②谱图重现性差，无CI的标准谱库。③反应气容易造成较高的背景。EICI（2）负化学电离(NCI)离子源MX+e¯(0~15eV)----MX-适合分析电负性强的元素（含卤素、氮、氧的化合物）特点：灵敏度高，选择性好注：正、负离子在离子源内均会同时产生，至于是检测正负离子还是负离子，取决于检测器的检测模式。对于多数有机化合物，负离子的CI谱图灵敏度要比正离子的CI谱图高2~3个数量级。负离子CI谱图已逐步成为复杂混合物的定量分析方法。Comparisonofionizationtechniques（三）质量分析器质量分析器的功能是将离子源内所产生的气态带电荷的离子，按照质荷比m/z进行分离。不同质量分析器的配置与功能分析器离子源扫描方式分辨率EICI全扫描SIMMRM子离子扫描母离子扫描中性丢失扫描MS/MS单级Q多级Q离子阱TOF磁场式√√√√√√√√√√√√√√√√√√×√×√××××√√√√×√××××√××××√多级MS××低低低中、高高179两组四极杆分别加上+(u+Vcont)和–(u+Vcont)，其中u直流电压部分，Vcont为射频电压部分=2f,f为频率。1、四极杆质量分析器（QuadrupoleMassAnalyser，Q)四极杆分析器由四根棒状电极组成。电极材料是镀金陶瓷或钼合金。相对两根电极间加有电压（Vdc+VRf），另外两根电极间加有-（Vdc+VRf）。其中Vdc为直流电压，VRf为射频电压。在极杆之间形成振荡电场。当加速后的一束混合质量的离子流进入该射频振荡电场时，在保持U/V比值及射频频率不变的情况下，同时增加或降低U与V（射频电压的幅值），对应于一定数值的U与V，该分析器只允许一种质荷比的离子作“稳定振荡”，通过四极杆到达检测器被检测，其余离子则因振幅不断增大，终因碰撞（非弹性碰撞）四极杆，损失能量后被真空系统抽走。线性变化U与V,并以V作为扫描参数，就可以使不同质荷比的离子依次通过四极杆到达检测器被检测。优点：1）结构简单、容易操作、价格便宜；2）仅用电场而不用磁场，无磁滞现象，扫描速度快，适合与色谱联机；3）操作时的真空度相对较低，特别适合与液相色谱联机。缺点：1）分辨率不高（R=103-104）；2）对较高质量的离子有质量歧视效应。由环形电极和上下两个端盖电极组成，在环形电极和端盖电极之间加上直流电压U与高频电压，当高频电压固定为某一值时，只能使某一质荷比的离子成为阱内的稳定离子，轨道振幅保持一定，可长时间留在肼内。当在引出电极上加负电压脉冲，可将阱内的稳定离子引出，再由检测器检测。2、离子阱质量分析器（IonTrap,IT）离子阱质谱由四极杆质谱仪发展而来。PrincipleofiontrapMS/MSEndcapRingDaughterionspectrumIonguideIondetectorSelectionandfragmentationcanberepeatedforMSnIonsarefragmentedIontrapfilledIonsareselectedCollisionCell++ParentionFragmentsArgonGasEnergyMS:IonswerecooledbyargongasMS/MS:Fragmentswereproducedbyargongasandenergy优点：1）单一的离子阱可实现多极“时间上”的串联MSn；2）结构简单、价格便宜，性能价格比高；3）灵敏度高，较四极质量分析器高达10-1000倍；4）质量范围大，可达6000。缺点：EI-IT质谱与标准谱有差别。在定量分析中，IT质量分析器也可实施全扫描，SIM扫描，但两者灵敏度相似，而四级杆质量分析器SIM扫描的灵敏度比全扫描的灵敏度高2个数量级，且检测限、线性范围、稳定性也略胜一筹，因此常用四级杆的GC-MS仪器实施定量分析。由于在离子阱中可做多级质谱，故常用这种仪器实施定性与结构分析。3.飞行时间质量分析器(TimeOfFlightMassAnalyser,TOF)离子以速度v进入自由空间（漂移区），假定离子在漂移区飞行的时间为T，漂移区长度为L，则：由上式可以看出，离子在漂移管中飞行的时间与离子质量的平方根成正比。对于能量相同的离子，离子的质量越大，达到接收器所用的时间越长，质量越小，所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子分开。适当增加漂移管的长度可以增加分辨率。zeVmLvLt2mzeVv2t为s数量级分离原理：优点：1）检测离子的质荷比范围非常宽；2）特别适合于与脉冲产生离子的电离源（MALDI-TOF）；3）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；4）扫描速度快，扫描一张质谱图约需10-5~10-6s，适合研究极快过程；缺点：分辨率随质荷比的增加而降低。（四）检测器：离子倍增管有正负离子两种检测模式（五）质谱仪的主要性能指标仪器类型主要性能指标质量范围分辨率灵敏度扫描速度GC-Q1~1200U1M~2.5MEI1pg八氟奈PCI1pg二苯酮NCI1pg八氟奈6000~10000U/SQC-QQQ2~4000U1M~2.5M同上6000~10000U/SGC-trap10~6000U＞1M同上＞6000UGC-TOF1~106U10000同上＞6000UGC-磁场式1~15000U＞10000同上＞6000U1.质量范围指质谱仪能检测到的最低和最高质量。质量范围取决于质量分析器的类型。2.质量准确度指离子质量测定的准确性。表示方法：①ΔM=M实测-M真实电磁式双聚焦质谱仪的离子质量精度为±0.0001amu。四极杆质谱仪的离子质量精度为±0.1amu。飞行时间质谱仪的离子质量精度为±0.0001amu。6|m-m|×10ppm)m实测真实真实（②一般在1～10ppm范围之内。Massmeasurementaccuracydependsonresolution•Highresolutionmeansbettermassaccuracy02000400060008000Counts2840284528502855Mass(m/z)Resolution=14200Resolution=4500Resolution=1810015ppmerror24ppmerror55ppmerror质量分析器质量准确度用途类型四级杆质谱离子阱质谱飞行时间质谱电磁场质谱0.1U0.1U0.0001U0.0001U给出整数质量给出整数质量给出精确质量给出精确质量低分辨低分辨高分辨高分辨不同类型仪器质量准确度3．分辨率分辨率即表示仪器分开两个相邻质量M和M+△M离子的能力，通常用R表示。ΔMMR（1）双峰法R＜1000低分辨R=3000~5000中分辨R≥10000高分辨ΔM=M2-M1不同类型的仪器，分辨率的定义与表示方法不一样。如磁式质谱仪常用双峰法计算分辨率，四极杆质谱仪常用单峰法计算分辨率。①等高双峰：一般常用10%峰谷定义。即对两个相等强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时，认为两峰已经分开。（2）单峰法MRΔMab=?aba——两峰间距，b——5%峰高处宽度②非等高双峰因为在质谱图中很难找到两个相邻的等高双峰，所以常用不等高双峰法计算分辨率。一般常用5%峰谷定义，四极杆或飞行时间等质谱仪的分辨率一般常用50%峰谷定义，同样因为实际工作中很难找到恰好在50％峰谷分开的峰，所以又简化为用单峰法表示。分辨率为单峰质量M除以50%峰高处的峰宽ΔM，即R=M/ΔM。613.96550000.1228R==(FWHW)对于磁式质谱仪，质量分离是不均匀的，在低质量端离子分散大，高质量端离子分散小，或者说M小时ΔM小，M大时ΔM也大。因此，仪器的分辨率R不随M变化。但对于四极杆类质谱仪，由于质量排列