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电泳技术琼脂糖凝胶电泳技术实验室常用琼脂糖有常熔点和低熔点两种类型。低熔点(LMP)可用于DNA片段的回收。由于其凝胶中无抑制酶，可在凝胶中进行酶切、连接。DNA电泳影响因素1DNA分子大小2DNA分子构型一般，质粒DNA分子超螺旋的最快、线状分子次之、开环分子最慢。3凝胶浓度对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的凝胶分离，对于大片段则用低浓度的凝胶。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2DNA电泳影响因素4电场强度电场强度高，电泳速度快，但分辨率低。5EB6电场缓冲液TAETris-乙酸TBETris-硼酸TPETris-磷酸50×TAEBuffer配制方法1.称量Tris242g，Na2EDTA.2H2O37.2g于1L烧杯中；2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；3.加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；4.加去离子水定容至1L后，室温保存。10×TBEBuffer配制方法1.称量Tris108g，Na2EDTA.2H2O7.44g，硼酸55g于1L烧杯中；2.加入约800ml去离子水，搅拌均匀；3.加去离子水定容至1L，室温保存。电泳示意图仪器和试剂仪器–电泳仪–电泳槽–灌胶模具等1电泳缓冲液2上样缓冲液常用电泳缓冲液作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液溴酚兰缓冲液100ml溴酚兰0.25g二甲苯青0.25g蔗糖40g上样缓冲液(1)6×上样缓冲液loadingbuffer100ml30mMEDTA36%(V/V)丙三醇0.05%(W/V)溴酚蓝PH7.0上样缓冲液(2)溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。1称取1gEB固体于专用容器中；2加入100ml的ddH2O，搅拌至溶解完；3转移至棕色瓶中，4℃避光保存。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。核酸染色剂DNA分子量标准操作步骤：1凝胶制备制备0.8%琼脂糖凝胶称取适量琼脂糖加入20mL0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃时，加入EB溶液。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2加样取10µlDNA样液与2µl上样buffer混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3电泳接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。4观察拍照聚丙烯酰胺凝胶电泳45%的聚丙烯酰胺1000ml丙烯酰胺434g甲叉双丙烯酰胺16g加600mlddH2O在37℃溶解，最后定容到1000ml.9%的聚丙烯酰胺凝胶150ml45%的聚丙烯酰胺30ml20×TBE7.5mlddH2O48ml尿素63g以上在37℃溶解，然后预冷到4℃，再加入1.6%AP(过硫酸铵)5ml和TEMED(四甲基乙二胺)75ul。0.2%的银染液500ml取硝酸银1.0g加超纯水充分溶解，然后定容到500ml,避光、低温保存备用。显影液400mlNaOH2g四硼酸钠0.08g甲醛1.6ml聚丙烯酰胺电泳基本步骤：(1)首先用自来水沾上洗涤剂把两块玻璃板擦洗干净，然后用蒸馏水冲洗，干燥后用无水乙醇仔细擦洗一遍，待酒精完全挥发后就可以制胶板。聚丙烯酰胺电泳基本步骤：(2)将两块玻璃板固定在电泳槽中，通过调整旁边的螺母使玻璃板受力均匀，向电泳槽中倒入少量的缓冲液检查是否漏液。(3)取50ml的9%变性聚丙烯酰胺胶液，用针筒将胶液缓缓注入两个玻璃板的夹层中，然后从灌胶口将梳子轻轻插入到合适位置，用吹风机吹热风以加速其凝固，在其凝固过程中，注意补充胶液。(4)将电泳槽装配好后，向槽中灌0.5XTBE，用吸水纸将电极擦干，以防止电泳时短路，恒电压350V预电泳30min.(5)将梳子小心拔出后就可以点样，每孔点样15µL。恒电压450V电泳3～4h至二甲苯青为胶板的2/3处，在电泳过程中要确保胶板温度不高于50℃以免玻璃板破裂。(6)电泳结束后，先将缓冲液倒出，再将玻璃板从电泳槽取下。然后小心地将胶板移入去离子水中，轻摇漂洗两次，每次1min。(7)倒入0.2%的AgNO3进行银染15min，然后用去离子水轻摇漂洗两次，每次1min。(8)用显影液处理20min,然后用去离子水轻摇漂洗两次，每次1min。(9)将胶板放在观灯机上用数码相机照相保存，进行数据分析与处理。思考题：1琼脂糖凝胶电泳基本过程2聚丙烯酰胺凝胶电泳基本过程