液相色谱基础知识1

液相色谱基础知识一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分HPLC的分离类型正相色谱(NP-HPLC)反相色谱(RP-HPLC)反相离子对色谱(RPIC)离子交换色谱(IEC)空间排阻色谱(SEC)手性化合物分离模式(Chiralseparationmode)液相色谱按两相极性不同分为:正相色谱反相色谱化合物保留时间随流动相配比的变化不同极性的化合物出峰顺序正相HPLC色谱柱硅胶型氰基型氨基型糖类分析二醇基型蛋白质分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi反相HPLC色谱柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty色谱柱:非极性溶剂:极性水/甲醇/乙腈反相色谱保留时间和疏水性OHOHC18(ODS)StrongWeak固定相作用C18(ODS)StrongC8samplesamplesampleC4MediumWeak液相色谱流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理流动相流动相选择注意事项：纯度：采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相配制时的顺序溶剂等级水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率水/MeOH梯度ODS柱鬼峰1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶剂等级鬼峰的出现溶剂等级溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱甲醇乙睛正己烷分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图溶剂等级溶剂前处理过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。过滤膜种类水系过滤膜有机系过滤膜溶剂前处理脱气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小气泡对测定的影响：1）柱压波动，流量偏小2）基线波动返回流路中形成气泡引起的问题改变保留时间和峰面积流动相中形成气泡对液流的不良影响泵中形成气泡使液流波动峰变形柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声输液泵输液泵控制方式：恒流控制恒压控制输液泵类型：注射泵柱塞往复泵隔膜泵柱塞往复泵单向阀马达和凸轮柱塞杆柱塞杆密封圈泵头10-100uL柱塞往复泵优点压力脉动小易于更换溶剂缺点需要更换柱塞杆密封圈等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂梯度洗脱A泵进样器色谱柱柱温箱检测器B泵AB时间B浓度分析时间长分离度差MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脱95%30%MeOH浓度梯度洗脱梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）混合器低压梯度比例阀高压梯度低压梯度脱气机高压/低压梯度系统返回高压梯度系统梯度准确度好系统复杂(需两台或三台泵)低压梯度系统系统简单需在线脱气机存在时间滞后效应高压/低压梯度系统进样器自动进样器手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入返回手动进样器的原理图装填状态进样状态返回进样体积检测器响应值定量管体积的一半3倍定量管体积全量注入部分注入进样体积与响应值关系返回柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性柱温控制的优点：色谱柱1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱）2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃3）流动相PH使用范围为2～7.5返回ODS柱的使用注意点：流动相注意点离子对试剂的使用具有缓冲盐流动相的使用分析结束及开始流动相平衡加快平衡时间异丙醇的使用LC检测器紫外可见检测器（UV/VIS）二极管阵列检测器（PDA）示差检测器（RID）电导检测器（CDD）荧光检测器（RF）电化学检测器（L-ECD）质谱检测器（MS）蒸发光散射检测器（ELSD）紫外可见检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL优点：1）对温度和流速变化不敏感2）可用于梯度分析缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外可见检测器样品池参比池光电管光电管EinEinEin光栅D2/W灯lEout紫外可见检测器岛津VP系列紫外检测器功能1）设定时间程序（波长切换等）2）双波长检测3）比例色谱，初步判断峰的纯度4）停泵扫描，确定组分最大吸收波长NEXT波长切换返回双波长检测返回比例色谱280nm220nmratio280/220返回波长扫描返回二极管阵列检测器（SPD－M10AVP）二十一世纪标准紫外检测器色谱信息：保留时间常规紫外检测器紫外光谱二极管阵列检测器样品池二极管阵列（512个单元）光栅D2/W灯每一单元可检测一个波长下的吸光度二极管阵列检测器三维谱图时间吸光度色谱光谱二极管阵列检测器的优点1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索NEXT峰纯度检验（3点光谱图比较）InitialdetectionpointFinaldetectionpointT1T3T2peaktopupslopedownslope1/21/3乙酰水杨酸下降点上升点,顶点峰纯度检验（3点光谱图比较）返回光谱库检索返回检测器原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定试样各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：1）对温度和压力变化敏感2）不能用于梯度分析示差折光检测器返回糖的色谱图AnalyticalConditionsColumn:Shim-packCLC-NH2Mobilephase:Acetonitrile/water=7/3Flowrate:1.0mL/minTemperature:AmbientPeaks1.甘油2.木糖3.果糖4.葡萄糖5.蔗糖6.甘露糖7.乳糖数据处理岛津液相色谱数据处理单元：CLASS－VP色谱工作站C－R6A色谱数据处理机C－R7A色谱数据处理机C－R8A色谱数据处理机返回液相色谱流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理