USP 微生物试验

新USP/EP/JP藥典微生物檢驗方法USPMicrobialLimitsMicrobialLimitTests”intotwochapters:61MicrobialEnumerationTests:Totalaerobicmicrobialcount(TAMC)-嗜氧性總生菌數Totalcombinedyeastsandmoldscount(TYMC)-總黴菌及總酵母菌數62TestsforspecifiedmicroorganismsNewHarmonisedMedia:ChangesAbsenceofSpecifiedMicroorganismsSalmonella-沙門氏桿菌Pseudomonasaeruginosa-綠膿桿菌Staphylococcusaureus-金黃色葡萄球菌Escherichiacoli-大腸桿菌Clostridiumspp.-梭狀產芽孢菌(formerlyCl.perfringens)Bile-TolerantGram-NegativeBacteria-膽鹽忍受性革蘭氏陰性菌(formerlyEnterobacteriaceae)Candidaalbicans-白色念珠菌(NEW)藥品的微生物檢驗主要包括無菌性試驗，總生菌數測定，黴菌及酵母菌數測定，以及病原菌的檢驗等。不同製劑的微生物檢驗要求不完全相同微生物限量檢驗法之目的，在於提供測定各種藥品自原料至最終成品中，嗜氧性總生菌數及特定生菌種類之檢驗方法在試驗之準備及操作中，對於檢品之處理需嚴格注意無菌操作技術勿受細菌污染MethodoftheexaminationMembranefiltrationPlate-countmethod-pour-platemethod-surface-spreadmethodMost-probable-numbermethodMembranefiltration＜0.45μm濾膜，每1個稀釋倍數至少進行二重覆TAMC:TSA30~35℃培養3~5天TYMC:SDA20~25℃培養5~7天結果判讀由兩個培養皿中菌落數之平均值乘以其最終稀釋倍數，即為每g或mL檢體之微生物總數若於10倍稀釋檢液之培養皿中無菌落產生，表至此檢體每g或每mL之微生物總數為1個以下。以＜1CFU/g（mL）表示Plate-countmethod–Pourplate每1個稀釋倍數至少進行二重覆TAMC:TSA30~35℃培養3~5天TYMC:SDA20~25℃培養5~7天Plate-countmethod-Surfacespread取不少於0.1mL進行塗抹每1個稀釋倍數至少進行二重覆TAMC:TSA30~35℃培養3~5天TYMC:SDA20~25℃培養5~7天結果判讀並選取＜250CFU(總生菌數)、＜50CFU(黴菌及酵母菌數)的菌落之兩個培養皿來計算菌落的數量由兩個培養皿中菌落數之平均值乘以其最終稀釋倍數，即為每g或mL檢體之微生物總數若於10倍稀釋檢液之培養皿中無菌落產生，表至此檢體每g或每mL之微生物總數為10個以下。以＜10CFU/g（mL）表示Most-probable-numbermethod10倍稀釋檢液A取1mL加入至加入3支「100」之試管及試管「A」B取試管「A」1mL加入至「10」之3支試管及試管「B」取試管「B」1mL加入至「1」之3支試管0.10.010.0019mLTSB9mLTSB9mLTSB9mLTSB對照組結果判讀對照組：應保持澄清（即應無菌生長），否則試驗無效試驗組：可由下表查出檢體每g或每mL最可能含有好氧性微生物之總數若在判讀上出現困難，則重新活化在相同的broth或TSA上，以30~35℃培養1~2天每組試管於培養終了顯示微生物生長之試管數檢體每g(mL)之MPN95%信賴區間每組試管於培養終了顯示微生物生長之試管數檢體每g(mL)之MPN95%信賴區間〝0.1〞〝0.01〞〝0.001〞〝0.1〞〝0.01〞〝0.001〞333＞1100212279-943321100200-4000211205-3833146090-1980210154-3833024040-990202205-3832329090-990201144-3532221030-4002009.21.5-3532115030-380130165-383209318-360121155-3831316030-380120114-3531212030-360111114-353117517-1991107.41.3-20310439-181102114-353026416-1811017.21.2-17301389-1041003.60.2-17300235-940309.43.5-35231369-940206.21.2-1.7230299-940116.11.2-1.7222359-9401030.1-10221289-9400130.1-9.5220215-40000＜30-9.4藥品預試驗連續稀釋檢液總生菌數-挑取StaphylococcusaureusPseudomonasaeruginosaBacillussubtilisCandidaalbicansAspergillusniger分別調配≦100CFU之菌液，取1mL加入5瓶10倍稀釋檢液中濾膜法傾注平板法塗抹法MPN法另作稀釋液空白培養基空白對照組30~35℃培養3~5天結果判讀嗜氧總生菌數藥品預試驗連續稀釋檢液黴菌與酵母菌-挑取CandidaalbicansAspergillusniger分別調配≦100CFU之菌液，取1mL加入2瓶10倍稀釋檢液中濾膜法傾注平板法塗抹法另作稀釋液空白培養基空白對照組20~25℃培養5~7天結果判讀黴菌及酵母菌數Testforspecifiedmicroorganisms1.大腸桿菌(Escherichiacoli)2.沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)3.金黃色葡萄球菌(Staphy.aureus)4.綠膿桿菌(Pseudo.aeruginosa)5.膽鹽忍受性革蘭氏陰性菌(Enterobacteriaceae)6.梭狀產芽孢菌(Clostridiumspp.)7.白色念珠菌(Candidaalbicans)測試培養基測試菌種及特性大腸桿菌MacConkeyBrothE.coli：生長、S.aureus：抑制MacConkeyAgarE.coli：生長及區分沙門氏菌Rappaport-VassiliadisBrothSalmonellaentericassp.entericaserotypetyphimurium：生長S.aureus：抑制Xylose-Lysine-DesoxycholateAgarSalmonellaentericassp.entericaserotypetyphimurium、E.coli：生長及區分綠膿桿菌CetrimideAgarP.aeruginosa：生長及區分E.coli：抑制PseudomonasagarPP.aeruginosa：生長及區分E.coli：抑制金黃色葡萄球菌MannitolSaltAgarS.aureus：生長及區分E.coli：抑制GrowthpromotionandInhibitorypropertiesofthemedia大腸桿菌（Escherichiacoli）之檢驗大腸桿菌革蘭氏陰性桿菌，腸桿菌科埃希氏菌屬(Escherichia)部分血清型的大腸桿菌可引起腸道感染，稱為致瀉性大腸桿菌根據其致病特點分為五種：腸病原性大腸桿菌(EPEC)腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)腸產毒性大腸桿菌(ETEC)腸出血性大腸桿菌(EHEC)腸黏附性大腸桿菌(EAEC)10倍稀釋檢液(TSB)預備試驗檢測試驗將稀釋檢液加菌培養在30~35℃，18~24小時稀釋檢液培養在30~35℃，18~24小時取1mL稀釋液，接種於100mLMacConkeyBroth，於42~44℃培養24~48小時劃線接種到MacConkeyAgar上，30~35℃培養18~72小時。若有疑似E.coli之可疑菌落，則可進行檢測試驗若無疑似E.coli之可疑菌落，表示藥品可能對E.coli具抑菌作用若MacConkeyAgar上有可疑菌落，則挑取可疑菌落進行：1.EMBagar2.Gramstain3.IMViCTest4.GNB-14消除藥品中抑菌作用之方法E.coli取1mL稀釋液，接種於100mLMacConkeyBroth，於42~44℃培養24~48小時劃線接種到MacConkeyAgar上，30~35℃培養18~72小時。EMBagarEscherichiacoliMacConkeyagar陰性桿菌培養基TSIACITURESIMVPORNARGLYSOXI生化試驗ASABGASH2SCITUREINDMOTIPAVPORNARGLYSOXI分數(4)(2)(1)(4)(2)(1)(4)(2)(1)(4)(2)(1)(2)(1)試驗結果+++---+---+-+-鑑定密碼70422菌種鑑定名稱EscherichiacoliTSIACITURESIMVPORNARGLYSOXI無色GNB-14沙門氏菌(Salmonellaspp.)之檢驗沙門氏菌革蘭氏陰性桿菌，沙門氏菌對外界抵抗力較強，但對熱耐受力差；對人類可引起傷寒和副傷寒腸炎、腹瀉（食物中毒）及敗血症等沙門氏菌引起的疾病稱為沙門氏(salmonellosis)。引起沙門氏菌性腹瀉最常見者有鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)及腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)，而引起敗血症常見者如和霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)引起沙門氏菌性腹瀉的藥品，常由動物性原料所製成，引起腹瀉菌量約為105cfu/g以上10倍稀釋檢液(TSB)預備試驗檢測試驗將稀釋檢液加菌培養在30~35℃，18~24小時稀釋檢液培養在30~35℃，18~24小時取0.1mL稀釋液，接種於10mLRVBroth，於30~35℃培養18~24小時劃線接種到XLD上，30~35℃培養18~48小時。若有疑似Salmonella之可疑菌落，則可進行檢測試驗若無疑似Salmonella之可疑菌落，表示藥品可能對Salmonella具抑菌作用若XLD上有可疑菌落，則挑取可疑菌落進行：1.BG、BSagar2.Gramstain3.TSIA4.Salmonella血清型試驗消除藥品中抑菌作用之方法Salmonella取0.1mL稀釋液，接種於10mLRVBroth，於30~35℃培養18~24小時劃線接種到XLD上，30~35℃培養18~48小時。BGagarBSAgarXLDagarSalmonellaspp.TSIA(TripleSugar-Iron-Agar)MediumSalmonellaspp.Salmonellaspp.-多價自體（O）抗血清試驗（PolyvalentSomatic（O）Test）1.將載玻片分為兩區，於其中1區滴1滴抗血清溶液，另1區則滴1滴無菌生理食鹽水2.取1loopTSI斜面上培養24~48小時之菌落，分別均勻懸浮於玻片上血清及生理食鹽水中3.前後搖動玻片1分鐘（不可使兩區之菌液互混），於光源下觀察結果金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)之檢驗金黃色葡萄球菌革蘭氏陽性球菌，於人體皮膚、毛髮及鼻腔、咽喉等黏膜，尤其是化膿的傷口；有些菌株污染食品後會產生腸毒素，達到一定劑量可引起腹瀉腸毒素之產生與食品的性質和組成分有關，一般說來pH為6.0~8.0，水分、蛋白質或澱粉含量比較豐富的食品中，該菌最易繁殖並產生毒素金黃色葡萄球菌對外界環境的抵抗力強於其他無芽孢菌，對乾燥有一定的耐受性預試驗檢測試驗將稀釋檢液加菌培養在30~35℃，18~24小時將檢液次培養到MSA上，培養在30~35℃，18~72小時稀釋檢液培養在30~35℃，18~24小時將