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基因工程学复习1、基因工程：利用体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因中分离出感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。2、生物技术概念及特征：利用活体生物或它们的产物来生产或修饰一种产品，以改良植物和动物，或发展具有特殊用途的微生物的技术。特征：21世纪最具有潜力的高新技术；多学科、交叉、综合的技术；影响最为深远最广泛的技术。3、限制性内切酶的定义、命名、识别序列的特点、末端类型：定义：广义上指限制修饰系统中的限制酶，狭义指Ⅱ型限制酶。命名：菌种-菌系编号-分离顺序。识别序列特点：长度4-8，一般6个碱基，大多回文结构，切割大多在DNA内部，限制酶切后产生两个末端，末端结构5-P和3-OH。末端类型：产生匹配黏端、平末端、非对称末端。4、异源同序酶：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶5、核酸酶S1的特点及用途：特点：糖蛋白（含糖量8%），最佳pH4.5，对热稳定，抗变性剂。用途：a.基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoⅢ、Bal31连用b.DNA定序分析c.S1作图法d.基因结构分析e.tRNA结构分析。6、分子克隆载体定义、特征：定义：一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。特点：a.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制b.至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入c.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。7、质粒的定义、特点：定义：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖宿主编码的酶和蛋白质），大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子，少数为线状。特点：a.质粒DNA复制与染色体复制无关b.质粒DNA以超螺旋形式存在c.质粒DNA可以接合转移d.质粒的不相容性和不相容群e.质粒DNA的消除--化学和物理方法f.质粒的整合--F因子又可整合到E.coli染色体中。8、质粒载体的种类、特点及用途：A.普通型载体：特点：至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一个用于转化体选择，另一个用于重组子的检测用途：基因组或cDNA文库的构建，次克隆或限制酶谱分析，外源DNA扩增B.表达型载体：特点：基因的启动子序列和终止子序列；一般无检测标记基因；克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；重组分子用凝胶电泳检出（依赖分子量差异）。类型：Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子Ⅱ型：转录起始区终止子：+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子Ⅲ型：转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子。用途：表达外源基因以产生大量外源基因产物；用于构建cDNA文库。9、M13（大肠杆菌单链丝状噬菌体载体）噬菌体的特点、结构、用途：特点：a.在IR区中插入一个lacZα基因，然后在该基因中逐渐构建一个多克隆位点区，ds-DNA可用常规方法直接导入，ss-DNA常用感染的方法b.噬菌斑的形成用于选择DNA导入的细胞，在X-Gal平板上形成的无色噬菌斑检测重组子结构：环状ssDNA，病毒颗粒呈丝状。用途：用于点突变、DNA的核苷酸序列测定和制备单链DNA探针。10、何为α互补，它在载体构建中有何作用？Β-半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活性，该蛋白质分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体的装配，后者具有β-半乳糖苷酶活性，只有两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称为α互补作用。在载体构建中可作为标记基因。11、人工染色体载体定义：用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。特点：模拟了染色体的复制方式，因此都能装载大片段DNA。用途：染色体图谱制作、基因组测序、基因簇克隆、基因组和功能基因组的研究。12、酵母菌人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建,由YLp经适当改造后构建成pYAC载体。必备元件：自主复制序列、着丝粒、两个端粒、选择标记。13、穿梭载体定义：能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的载体，主要是质粒载体14、整合载体定义：在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体。15、DNA的质量评估：1）凝胶电泳2）光密度值测定3）限制酶切分析16、分子杂交：分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。17、转导：由噬菌体将细菌基因从一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程18、转化：即来自一个细菌细胞（供体）的DNA片段被另一个细胞（受体）所吸收，随后同受体染色体一起进行重组。19、生物芯片：是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。20、基因芯片的制作简要步骤：基因芯片又称DNA芯片或DNA阵列，是将DNA分子固定在固相支持物上，并与标记的样品杂交，从而检测样品中mRNA分子的表达量或进行基因突变体检测的技术。步骤：样品的标记处理、芯片制作、分子杂交、信号的检测、数据处理21、PCR技术：即聚合酶链式反应，是通过模拟体内DNA复制的方法，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。22、如何设计引物：①长度：至少16bp，通常为18-30bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。②引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。对于14-70个核苷酸的引物可用以下公式计算。Tm=81.5+16.6（1g[K+]）+0.41（G+C）%-（675/N）N表示引物的核苷酸数目，[K+]表示单价离子即钾离子的浓度。③避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。④G+C含量：尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3'末端的重复排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC连排。23、两种定序方法的优缺点：a.化学法：优点：所有片段具有相同的标记强度；一次可以读出250-400个核苷酸；定序分析不需要次克隆；不受二级结构区的影响；多A区定序清楚；适合500bp或以下DNA片段的定序分析。缺点:需限制酶图；需放射自显影时间较长和增感屏；DNA片段需经凝胶纯化；多嘧啶区定序不够清楚；所用试剂为诱变剂和致癌物质。b.酶法：优点:反应简单，易于操作；具有配套载体和宿主菌；不一定需要详尽的限制酶图；可采用多种方法进行次克隆。缺点:DNA带放射强度不均匀；下游碱基阅读困难；需要大量的次克隆和鉴定工作；二级结构区和多C区定序困难24、体外诱变：是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因，用于基因工程和蛋白工程的研究。25、增变菌种：将大肠杆菌与DNA错配矫正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株。26、基因组：单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组。27、基因组DNA文库：将某种生物的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。28、cDNA文库定义、构建步骤：一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。步骤：a.细胞总RNA的提取和mRNA的分离b.第一链cDNA合成c.第二链cDNA合成（自身引导法、置换合成法、引导合成法）d.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入特点：基因特异性、器官特异性、代谢或发育特异性、不均匀性、各cDNA均可获得表达29、基因克隆筛选策略：表型筛选法、杂交筛选和PCR筛选、免疫筛选、酵母双杂交系统30、表型筛选法：就是根据目的基因编码比较特殊的功能，并且其与载体作用可以在宿主菌中表达该基因，表现出其特殊的功能所决定的表形性状来，这样就很容易通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因。31、遗传作图：采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。32、物理作图：采用分子生物学方法直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组上的实际位置。33、基因组工程：对大片段的基因或基因簇进行功能分析或除去非必需遗传区域，以及对染色体进行可控的重组。34、细菌及酵母作为表达系统的比较及优缺点：大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统，是分子生物学产业化发展的重要工具。此系统具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优点；但同时该表达系统也有明显的缺陷．如表达产物(蛋白质)缺少翻译后修饰，高表达时易折叠错误导致表达产物没有活性，而且大肠杆菌本身含有内毒素和有毒蛋白，可能混杂在终产物里，导致在医药方面的使用受到局限。酵母是单细胞低等真核微生物，作为表达工具有独特的优点，如表达产物可以糖基化且属分泌型表达，有利于蛋白的分离纯化，能适应工业化生产的需要，易培养、繁殖快，遗传背景清楚，便于进行遗传操作；而且酵母毒性比细菌小，安全可靠，已长期广泛应用于酿酒和食品工业，因此酵母作为基因表达系统特别是在大分子真核生物基因研究方面得到日益广泛的应用。但是，由于通过酵母表达系统表达的外源蛋白质可能形成聚合体而影响表达效率，其信号肽加工不完全或蛋白质的内部降解等，可造成表达产物的差异，产生极不均一的现象，为表达产物纯化和工业化生产带来了困难。35、外源基因在大肠杆菌中的表达方式及其运行：外源基因表达的方式：1）外源基因以融合蛋白形式表达：融合表达是指目的基因与编码具有特殊活性的多肽和蛋白质的基因融合，构建成一融合蛋白基因。2）构建可分泌蛋白，分泌到胞外培养基中：通常位于蛋白质N段的称为信号肽的一段氨基酸序列会帮助蛋白通过细胞膜。通过基因操作可以在外源蛋白的N端添加编码信号肽的DNA序列形成一个分泌蛋白。3）外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达：包涵体是致密的不溶性复合物含有大部分的表达蛋白，可以抵抗宿主细胞中蛋白酶的降解，也便于纯化。4）外源基因在细胞表面的表达（表面展示技术）：微生物细胞表面展示技术是把目的蛋白基因序列（外源蛋白）与特定的载体蛋白基因序列（定位序列）融合后导入微生物宿主细胞从而使目的蛋白表达并定位于微生物细胞表面。