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蛋白质检测技术复习一、蛋白质浓度检测有哪些常用方法，简要说明他们的优缺点。a.克氏定氮法：优点：经典、结果比较准确、可以测量固液态样品、目前已经可仪器化。缺点：繁琐（消化、蒸馏、滴定）、费时（有非蛋白氮干扰）b.紫外吸收法：优点：简单、快速、灵敏度高、微量、适合蛋白质纯化时检测蛋白浓度。缺点：不太准确、只用于测定液体、要求杂质少c.Folin-酚法：优点：经典、灵敏性和准确性高、方便、成本低。缺点：易受还原物质干扰、去污剂有干扰、费时、专一性差d.二奎琳甲酸法：优点：经典、方便、有试剂盒供应。缺点：不耐受还原剂e.染料结合法：优点：灵敏度高、操作简单、干扰因素较少、应用广泛。缺点：SDS干扰、不同蛋白显色不同、染料干扰。二、特定蛋白组分含量的测定a.放射免疫分析：高灵敏度、试剂盒；结果是免疫活性，而不是实际含量；有放射性危害。b.Elisa:无放射性危害，操作简便，加样方便，便于自动化，试剂盒c.Hplc:可同时对多种蛋白进行定量，准确度较高；每次只能测定一个样品，需要昂贵的高效液相色谱仪。d.电泳：不同蛋白有染色方面的误差三、解释下列名词1、蛋白组学技术：大规模研究细胞、有机体或生物体中的蛋白质的学科2、固相pH梯度等电聚焦电泳：一种新型等点聚焦电泳法，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合缓冲基团通过乙烯键聚合至丙烯酰胺骨架中而形成的pH梯度，十分稳定。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗作用，因而可以进行特别稳定的IEF，分离达到真正的平衡。3、亲和层析：利用蛋白质与某些物质的专一性可逆结合，将蛋白质分子分离的技术。4、氨基酸原位分析：采用SDS-PAGE分离的蛋白很难从凝胶上洗脱下来，可采用电印迹法把样品转移到PVDF膜上，然后在膜上直接进行盐酸水解和氨基酸分析，称原位分析。5、电泳：指带电荷的颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极运动的现象。6、肽谱：指蛋白质被酶解或化学裂解后肽段的分离分析。7、肽指纹图谱：蛋白质酶切位点被专一的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。8、指纹谱：由于每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被水解后，残生的肽片段序列也不相同，其肽混合物质量数亦具有特异性，所以称为指纹谱。9、质谱：是带电原子、分子或分子碎片按质荷比的大小顺序排列的图谱。10、质谱仪：一类能使物质粒子高化成离子并通过电场、磁场将他们按空间位置。时间先后或轨道稳定是否实现质荷比分离，并检测强度后，进行物质分析的仪器。11、蛋白质印迹：把电泳分离的蛋白转移到固定基质上并进行检测的过程。12、双向电泳：蛋白组学研究的核心技术，先进行IEF,再进行SDS-PAGE分离。三、如何检测蛋白质纯度？需要注意什么？可根据蛋白质的分子大小、形状、电荷等进行分析，至少利用两种不同的原理进行分析常用方法：电泳、色谱、CE、MS、其他；四、质谱技术在蛋白质分析中由什么作用？a.蛋白质序列的测定：用3-4种不同蛋白酶对蛋白质水解，然后把各种酶解片段用HPLC分析得到纯肽或简单的混合肽，最后用MS分析各种组分顺序，从不同蛋白酶片段找到重叠序列，得到蛋白质全部序列。b.蛋白质、多肽纯度分析：只要有质量差异的杂质都可以检测出来。c.蛋白质的鉴定：将双向凝胶电泳显色的蛋白质点切下来，用蛋白酶水解，获得肽的混合物，再用质谱分析的到肽片段的质量图谱，通过PMF专业蛋白数据库检索，进行蛋白质鉴定d.蛋白质的分子量测定。五、简单介绍westernblot技术的主要过程，该技术有何用途？a.凝胶上的蛋白质转移到膜上：电泳转移或直接点样b.封闭：用非特异性的分子封闭膜上未吸附蛋白的区域。c.用探针检测膜上特异的或感兴趣的蛋白。用途：检测生物样品中特异蛋白质的定性方法，也可以用于同一蛋白质在不同细胞或不同条件下的半定量分析。六、生物工程产品的质量控制主要包括哪些方面？含量、纯度、分子量、PI、氨基酸定量分析、肽谱、质谱、N-末端序列分析、C-末端序列分析、二硫键分析、突变点分析、添加剂问题。七、蛋白质分离纯化的基本思路是什么？A.选择目的蛋白：含量丰富、稳定的材料。B.建立灵敏、特异的检测方法，分步检测含量、纯度、活性等。C.抽提：细胞破碎后，将蛋白质转移到抽提液中。D.确定分离纯化的方法，根据要求纯化。E.防止蛋白质的变性。F.将昂贵、复杂的分离过程放最后。八、介绍对蛋白质定性分析的主要方法及其原理。序列分析：edman酶降解，序列分析仪肽质量酶谱：将蛋白水解成片段，再用质谱、色谱、电泳分离、比对Westernblot：利用抗原--抗体反应九、蛋白质检测分析需要哪些设备？Γ-射线计数器、离心机、蛋白质序列仪、层析柱、质谱仪十、蛋白组学研究的基本过程包括哪些？样品制备--双向电泳--斑点检测--图像分析--切去斑点--斑点溶解，质谱分析--生物信息学分析十一、简单介绍生物样品中氨基酸组成分析的思路，包括哪些技术环节？把蛋白质水解成游离氨基酸，再用色谱进行分离定量。主要技术环节：盐酸真空条件下水解、用HPLC分离定量。十二、介绍蛋白质相互作用研究中的一些方法。Westernblot、生物传感器、免疫共沉淀、其他十三、SDS-PAGE的主要原理是什么？介绍其基本流程。在PAGE体系中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS），把蛋白质样品和含还原剂的样品缓冲液混合，在100度条件下加热3-5分钟，使蛋白质完全解离为亚基并与SDS结合。肽链结合大量SDS，所有蛋白质具有相同的核质比。此时蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率与蛋白质所带电荷无关，只与蛋白质分子的大小有关。从而将不同分子量的蛋白质分离。操作流程：A.样品处理：a.分析蛋白质溶液浓度，根据凝胶厚度和加样孔大小、染色方法等，调整蛋白质溶液浓度。b.与样品缓冲液混合，在100度条件下加热3-5分钟，使蛋白质完全解离为亚基并与SDS结合。c.处理好的样品冰箱冷藏可短期保存。B.凝胶制备：准备凝胶玻璃板，先配置分离胶，灌胶后轻轻加入一层薄水，待分离胶凝固后，准备浓缩胶，迅速灌胶，并马上插梳子。C.加样：安装好电泳装置，加入电极缓冲液，加样。D.电泳：恒压，电压高需要冷却装置，待指示剂接近凝胶底部时关闭电源，取下玻璃板，轻轻分开后，切下左上角做标记。D.染色和获取图像：用CBB-G250染色银染。采用凝胶成像系统、扫描仪等获取电泳图片，并利用软件分析。