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目录绪论（序论）．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11．基因、克隆的概念．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12．基因克隆研究的主要内容．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12．1克隆工具的研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12．2技术方法的研究.．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12．3研究对象——目的基因的研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12．4过程研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13．克隆研究的历史．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2一、基因克隆技术．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21．基因克隆技术的特点．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32．基本方法与技术．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32．1传统的方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32．2近期发展的经典方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．33．基因克隆技术的基本步骤．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．54．基因克隆技术的表达系统．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6二、基因克隆技术早期开创性研究成就和近来的研究成果．．．．．．．．．．．．．．．．61．微生物的基因克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．61．1微生物基因克隆的工具酶．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．61．2微生物基因克隆载体．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．61．3微生物人为克隆载体的宿主．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．71．4达载体的构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．81.5融合蛋白的表达．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．92．植物的基因克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．93．动物的基因克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10三、基因克隆技术的具体应用及发展方向．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．111.繁殖性克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．111.1基因克隆技术与遗传育种．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．111.2转基因动植物的培育．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．111.3医学上的应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．111．4基因克隆和DNA分析在法医学和考古学中的应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．121.5特殊动物基因资源的保护．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．121.6建立动物模型，制备医用实验动物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．121.7生物学基础研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．122.治疗性克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12四、基因克隆技术意义与展望．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12五、结论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12六、谢辞．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13参考文献．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．141绪论（序论）1．基因、克隆的概念基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓“种瓜得瓜，种豆得豆”“龙生龙，凤生凤，耗子生儿会打洞”。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。克隆（cloning）这个词源于希腊语中clonos，即嫩枝，clonizo是砍下嫩枝的意思。许多世纪以来，克隆就广泛地应用与农业方面，用这种方法不使用种子就可以把老树的嫩枝经插条变成树苗。英文clone就是使用了这个意思，而克隆是clone的音译。广义上讲，无性繁殖与克隆不同，前者指不经雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。植物的压条或嫁接方式产生的新个体也叫无性生殖。后者是人工遗传操作动物繁殖的过程。狭义上二者相同。在生物的分子、细胞、个体三个不同层次上，“克隆”有不同的含义。在分子水平上，用分子生物学技术利用细菌或病毒使原来某一片段DNA形成一群DNA分子的过程，叫做分子克隆或DNA克隆，而且相同分子叫一个克隆。在生物学中，细胞克隆技术的正规名词为细胞培养技术，包括微生物、动物和植物细胞以及动植物组织的培养，而得到大量的细胞或其代谢产物。自然界普遍存在植物、微生物的克隆，即使高等动物也不例外，同卵双胞胎实际上就是一种胚胎水平上的克隆。2．基因克隆研究的主要内容2．1克隆工具的研究主要的基因克隆载体：原核和真核载体、克隆和表达载体、质粒载体、噬菌体、病毒、黏粒载体等。在细胞内进行自我复制的DNA分子，就是外源基因的运载体，有了它，外源DNA才能进入受体细胞生存和繁殖，从而使基因克隆技术成为可能。主要的工具酶：如限制性核酸内切酶、DNA连接与聚合酶、单链核酸内切酶、核酸外切酶、各种修饰酶等，它们使基因克隆操作在技术上成为可能。以上均在正文简介。2．2技术方法的研究新的克隆方法不断涌现，如以PCR为基础的差异筛选技术、长片段DNA序列测定技术、高通量的基因芯片技术等。2．3研究对象——目的基因的研究2．4过程研究2．4．1供核细胞的来源胚胎细胞和动物胎儿细胞是克隆动物的理想核供体来源。2．4．2细胞质受体的来源2．4．3重构胚的核质适应机理核移植重构胚胎融合后核质间细胞周期是否同期化、核重编程的能力如何和核质相适应的机制等。22．4．4支持体系研究包括了供核细胞和胞质受体的采集技术和培养体系研究；核移植操作技术和有关设备研究等。2．4．5重构胚胎体内和体外培养技术孕育新生命的重构胚胎需要在什么条件下培养发育，是提高克隆效率的关键。2．4．6实用化研究研究的目的及意义：是为了用它来造福人类，为人类带来利益。如研究（转）基因克隆技术，以获得更多的转基因动物；培育动植物优良品种及医用实验动物；异种动物克隆，用于珍稀濒危动物的克隆和繁殖等等。2．4．7应解决的问题目前（基因）克隆在理论和技术实践方面都还不很成熟，许多应用还处在试验阶段，因此有赖于科学的进步和研究者的不懈努力，争取将它做的更好更美，早日为人类利益服务。3．克隆研究的历史1932年，英国作家赫胥黎曾在他的小说《美丽的新世界》中预言，人类科技发展到复制人类自身时，便是世界混乱之日。明代小说家吴承恩在《西游记》中描写无所不能、会七十二变的孙悟空时，特别描写了他用来战胜敌人的分身术：拔下一撮毛，吹上一口气，就能变成无数个和他一模一样的孙悟空……人们充满复制自我的幻想。1958年，Steward用胡萝卜根细胞经培养产生植株。1962年，Gurdon用成体细胞克隆了青蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组研究鱼类胚胎细胞核移植获得成功。同年，Haldane创造了“clone”一词。1981年，Illmensee等人用鼠胚胎细胞培育出3只发育正常的小鼠，其后许多科学家都用动物成熟胚胎细胞培育了正常的克隆羊、兔、牛等。1982年，1999年，2002年科学家们分别克隆出了带有人类基因的转基鼠，克隆羊、牛等。2001年，科学家将死亡的欧洲盘羊的颗粒细胞移入其卵母细胞构建异种重构胚，移植后获得一个正常体细胞克隆羊，为濒危物种保护提供了借鉴。2003年，世界上第一匹克隆骡子、马诞生，开创了动物生下它自己的克隆体的先河。我国哺乳动物细胞核移植已取得成功，至1996年我国科学家已先后获得克隆山羊、牛、猪。以上只是部分突出例子，从克隆发明至今，科学家的步伐一直在其研究领域上前行。一、基因克隆技术先介绍两个概念：文献中，基因克隆指在体外借助于能自我复制的载体，将目的基因引入到受体（宿主）细胞中进行增殖，以获得大量的DNA片段，或以此为基础，通过工程方法表达出大量相应的基因（蛋白质）产物。一般来说，此技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。而基因工程又称为重组DNA技术、基因克隆、遗传工程、基因操3作等。其核心技术是DNA重组，即基因克隆技术。指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。它按照人们的需要，运用载体将外源基因导入受体细胞，使之获得新的遗传性状或产生所需的基因产物的过程。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子，在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程即为基因克隆。1．基因克隆技术的特点：是可以使一个生物体获得与之原有形状完全无关的新性能，从而使人们可在大量扩增的细胞中，将控制某些新型药物合成的目的基因克隆出来，转移到受体细胞进行高效表达，而提取纯化得到大量珍贵药物。基因克隆技术是一种崭新的获得生物新品种的育种技术，与其他育种技术相比，具有如下特点：1．1能像工程一样可按人们的意愿来事先设计和控制。1．2人工的、离体的、分子水平上所进行的遗传重组。1．3能在动植物和微生物间进行任意、定向的超远源杂交。2．基本方法与技术2．1传统的方法．2．1．1化学合成法：指根据某种已知基因产物氨基酸序列，仔细选择密码子，可推导出该编码基因的核苷酸序列，然后将核苷酸片段挨着缩合起来，成为一个个基因片段。2．1．2物理化学法．2．1．2．1密度梯度离心法：利用密度梯度超离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分开，进而通过与某种放射性标记的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。2．1．2．2单链酶法：用加热或变性试剂处理DNA，双链上