医学检验方法学的评价

检验医学方法学的评价泸州医学院附属医院检验科2020/4/2412020/4/242好方法：灵敏度高重复性好特异性高准确度好抗干扰强适用性强价格低概述2020/4/243掌握方法学学评价是检验科中、高级人员的基本功之一。检验科要不断引进或建立新的诊断试验，引进什么试验，对实验结果如何解释和如何得到有效应用，这些都离不开对试验的评价。然而同国外相比还存在着较大差距，今后对这方面的学习和实践应该加强。概述第一节检验方法学评价的重要性2020/4/244一、医学检验方法的建立是为了诊断疾病。在建立或引进一个新的试验时，必须了解该试验方法的基本性能，因此应该进行方法学评价。二、检验方法的评价是合理解释实验室数据的基础。2020/4/245检验科的工作目标主要是：1．能为临床提供可靠的数据；2．为临床提供充分的检验项目和及时的报告；3．为临床能提供专业咨询。因此在引进新技术的同时，必须及时开展与临床的合作和对话，以强化对实验室数据的合理解释与有效利用，及时将数据转化为高层次的临床判断分析信息。2020/4/247三、从医学检验事业的发展要素来看，掌握检验方法学评价在检验工作中有着重要作用。检验科人员组成应包括方法学家，其工作以开展新方法进行方法学评价，提高检验质量为主。2020/4/248第二节评价实验的设计及统计指标的选择方法评价的基本内容是通过实验途径,测定并评价它的准确度和精密度。不论准确度和精密度，都强调的是误差，评价过程就是对误差的测定。2020/4/2491．预评价：主要研究候选方法的最适条件。这些条件包括：⑴、试剂的浓度；⑵、缓冲液种类；⑶、离子强度及pH值；⑷、标本与试剂的容积比；一、方法学评价计划⑸、反应温度与时间；⑹、吸收曲线与波长选择；⑺、线性范围等。2020/4/24102020/4/24112．初步评价：⑴、用标准液作线性及批内重复实验；⑵、用血清作批内及天内重复实验；⑶、进行回收实验；⑷、进行干扰实验。方法学评价计划3．最后评价：⑴、作日间重复实验；⑵、方法学比较实验；⑶、判断方法的可接受性；⑷、进行临床相关研究。2020/4/2412方法学评价计划4．方法应用：⑴、建立质控系统；⑵、训练操作者；⑶、引进常规应用；⑷、常规性能管理。2020/4/2413方法学评价计划2020/4/2414（一）、方法的分级临床生化成分的测定方法很多，根据其准确度与精密度的不同可以分为三级。二、方法的选择1、决定性方法（Definitivemethods）指准确度最高，系统误差最小，经过详细研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法，测定结果为“确定值”，与“真值”最接近。2020/4/2415方法的分级条件：技术要求太高且复杂，费用昂贵，仪器精密、试剂最纯。用途：不能直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于发展及评价参考方法和标准品。2020/4/24162、参考方法（Referencemethods）指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差很小，与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性、直线性及较宽的分析范围。2020/4/2417方法的分级条件：所需仪器的要求也较高，昂贵，试剂要求二级标准品，纯度高、杂质少，在条件优越的实验室可进行常规工作。用途：主要应用于鉴定常规方法，评价其误差大小，干扰因素，并决定其是否可以被接受。它也用于鉴定二级标准品，为质控血清定值，也可用于评价商品试剂盒等。2020/4/24182020/4/24193、常规方法（routinemethod）性能指标符合临床或其它目的需要，有适当的分析范围，而且经济实用。常规方法分为偏差已知的方法和偏差未知的方法。条件：常规方法在作出评价以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法。用途：普通实验室。方法的分级临床化学方法之间关系可见下图。2020/4/2420方法的分级国际标准化委员会将标准品（参考物）的定义暂定为：它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定，被用于校正仪器或证实一种测定方法的物质，并将其分成三级。标准物质的定值结果一般表示为：标准值±总不确定度。2020/4/2421（二）标准品的分级1、一级标准物质（primaryreferencematerial）一级标准品（原级参考物）是已经确定的稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量。它可用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为“二级标准品”定值。2020/4/2422标准品的分级2、二级标准物质（secondaryreferencematerial）二级标准物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定，主要用于常规方法的标化或为控制物定值。二级标准品或是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），或存在于相似基质中。2020/4/2423标准品的分级2020/4/24243、校准物（calibrator）用二级标准物质校准，常规方法定值。用于对常规方法和仪器的校准。标准品的分级4、质控物（controlmaterial）具有与检测过程相适应的特性，其成份与检测样本的基质相同或相似。用于质量控制，不用于标化。2020/4/2425标准品的分级国际临床化学协会（IFCC）提出：常规方法应具有实用性和可靠性两方面的性能指标，至于某一项具体分析方法所应具有的性能标准，可由临床实验室根据采用这一试验的目的决定。2020/4/2426三、方法选择的要求2020/4/24271、实用性一般应具备：⑴、微量快速能便于急诊，适合成套项目分析；⑵、费用低廉，包括劳动力与试剂、设备及一般管理费用等；⑶、方法简便；⑷、应用安全可靠。方法选择的要求2020/4/24282、可靠性一般具有较高的精密度和准确度，以及较大的检测能力。⑴、精密度变异系数（CV％）一般应小于5％。⑵、准确度与特异性准确度是指测定值与“真值”的符合程度。一般偏差系数（CB）应小于5％。特异性是指只对待测物质起化学反应，不与其它结构类似的化合物发生反应。⑶、检测能力即“检测限度”，或“检出限”。检出限通常是指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小值。方法选择的要求2020/4/2429（一）广泛查阅文献根据方法选择的要求对已发表的各种方法进行比较与检验，确定哪些方法有充分的科学根据及真实的使用价值。四、方法选择的步骤2020/4/2430（二）选定候选方法经初步选定的方法称为候选方法。候选方法确定后，应该写出该法的原理与参考文献，所用仪器、试剂的来源、牌号、纯度（或配套试剂盒），标本收集要求，详细的操作步骤，标准曲线和结果计算，文献中列出的性能指标，参考值与参考范围，以及其它应注意的事项与安全防护措施等。方法选择的步骤（一）、方法建立的原理确定临床生化方法按其传统分类可分为光谱法、层析法、电泳法、酶法、电化学法、分子生物学和免疫化学法等，这些方法的建立首先要根据其技术的原理和被测物质的物理化学性质来确定其方法建立的原理。2020/4/2431五、方法的建立（二）、方法建立时的条件选择在方法建立的原理确定后，尚需根据其原理来选择合适的条件，以保证所建的方法可靠。下面以光度法为例介绍其条件选择的主要环节：2020/4/2432方法的建立颜色反应是光度分析的基础，因此，用作光度测定的颜色反应至少要具备以下几条：a、反应有较高的特异性，从而干扰小；b、反应产生的有色物质吸光系数要大，大者灵敏度高；c、有色产物的离解度要小，小则稳定；d、此外，还要求有色产物有恒定的组成成分，使产生的颜色稳定。2020/4/2433方法建立时的条件选择由于影响颜色反应的因素很多，如温度、pH、试剂浓度、反应的时间等等。这些因素在建立新方法时都要逐项试验，确定最佳实验条件2020/4/2434方法建立时的条件选择2020/4/24351、选择合适的吸收光谱—确定波长实际上就是测定颜色反应产生的光吸收曲线。方法是在整个可见光区（400-700nm）进行波长扫描，同时，还应以同法分别测定其空白液和标准物颜色产物的吸收曲线。方法建立时的条件选择△A＝A标准－A空白△A最大时的波长(即干扰最小)为最适波长2020/4/2436方法建立时的条件选择2020/4/2437方法建立时的条件选择2、测定方法适用的浓度范围——线性实验根据郎伯-比耳定律吸光度应与溶液的浓度成正比。测定方法适用的浓度范围是指分析的浓度范围在直线线性段，浓度与吸光度之比为一常数，此时直线上任何一点的斜率tanθ相等，即：tanθ＝A1/C1＝A2/C2＝A3/C3＝……＝An/Cn＝K此处K即为校正常数，可用于结果计算。2020/4/2438方法建立时的条件选择通常稀溶液都是符合比耳定律的，但在浓度过高和过低时往往都不呈直线（见下图），说明低浓度部分亦有仪器的灵敏度和方法的检测能力限制，所以，具体的测定就宜选择在直线段浓度范围内进行。2020/4/2439方法建立时的条件选择2020/4/2440AC线性段θ方法建立时的条件选择3、观察影响颜色反应的因素影响颜色反应的主要因素有：溶液pH的影响、杂质的影响、反应的温度和时间、以及颜色的稳定性等。这些都是光度法测定误差的主要来源。都需要通过实验来观察并控制在一个适宜的范围内。从而保证方法的准确性和精密性。2020/4/2441方法建立时的条件选择⑴溶液pH的影响有些溶液的颜色对pH值的改变非常灵敏。因此，在建立方法时可在不同pH值条件下（其它条件不变）令其反应，以观察颜色反应的吸光度变化，从而选择合适的pH值范围来保证颜色反应，以求较高的灵敏度和较好的线性。有时还需用相应的pH缓冲液来维持反应的pH，以利颜色反应的正常进行。2020/4/2442观察影响颜色反应的因素⑵杂质的影响由于临床标本中除含待测物质外，还含有许多非测定物质，成分十分复杂，影响检测结果。为此就需要进一步改进方法，或设立标本空白，或将标本作适当处理，除去干扰物，或加入合适的干扰物掩蔽剂等，以提高方法的特异性。2020/4/2443观察影响颜色反应的因素特异性和干扰的区别：特异性是指检测试剂只与特定的被检测物反应而不与其他物质发生反应，因此可疑物本身和分析试剂反应，则方法特异性差；干扰是指某些物质本身并不与检测试剂反应，但是它能影响被测定物与检测试剂间反应的某一步骤，从而影响检测结果。例：血糖测定，用邻甲苯胺试剂，半乳糖、甘露糖等也与试剂反应，这是特异性不足，而在葡萄糖氧化酶法测定中，尿酸可与H2O2反应，使部分H2O2不能参与过氧化物酶的第二步反应，造成对显色的干扰，因此，尿酸对该反应有干扰，而本身不是被测定。2020/4/2444观察影响颜色反应的因素⑶反应的温度和时间有些有色物质能迅速反应生成，另一些有色物质须经过相当长时间后反应才能完全。提高反应的温度可以加速化学反应，缩短反应的时间。因此这可以在不同的温度下（如25℃，30℃，37℃）令其反应，通过检测吸光度来观察各自反应终点时间（一般达到反应终点，随后测定的吸光度不再变化），以选定适宜临床应用的反应最佳温度和时间。2020/4/2445观察影响颜色反应的因素⑷稳定性试验了解呈色反应达峰值的时间，稳定多长时间，从而确定比色时间。即刻及室温放置不同时间，每5分钟测定一次。根据其吸光度的变化确定方法稳定的时间范围。试剂空白：试剂本身是否稳定标准：产物是否稳定样品：血清中的其它物质是否影响反应的稳定性2020/4/2446观察影响颜色反应的因素2020/4/2447一、重复性试验目的在于考察候选方法的随机误差，重复性试验的方法是对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定。第三节、方法学评价的实验方法及指标（一）试验形式与方法1、批内重复性试验：可以用同一份标本在相当短的时间内，按规定的操作方法，在较稳定的条件下，作多次（一般为20次）重复性测定。计算其X、S与CV%。不同性质的分析对CV%值的要求不同，一般应小于5％，精密的分析或多次平行测定，要求小于2％。2020/4/2448重复性试验2、天内重复性试验：在一天内对一个或数个标本作数批重复