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中空纤维技术以及应用简介YangChao(杨超),GEProductSpecialist1391-184-58172012.08.09膜分离技术的基本概念切向流过滤技术的优化中空纤维技术的应用举例中空纤维膜分离产品总结内容膜分离技术的定义及原理滤膜：多孔的高分子聚合物制成的一层或多层的薄膜状物质;膜分离：利用滤膜将目标物分开的一种物理操作方法.滤膜流体流体有机合成膜Polysulfone(PS)聚砜Polyethersulfone(PES)聚醚砜OSOOnCHFHFCnPolyvinylideneFluoride(PVDF)聚偏氟乙烯nSOOOCCH3CH3O纤维素材质CelluloseTriacetate醋酸纤维素Cellulose纤维素RegeneratedCellulose(RC)再生纤维素nOCOCH3OCOCH3CH2OCOCH3nOHHOCH2OHnOHHHOHHH根据膜孔径分类微滤膜结构Skin(5µm)Support(100µm)超滤膜结构Skin(3µm)Support(100µm)大孔隙结构无大孔隙结构根据过滤原理分类死端过滤•过程控制简单•用于溶液预处理，除菌•用于低浓度样品的处理•膜载量较低FeedFlowFiltrateFlowTimeFlowPressure根据过滤原理分类切向流过滤•过程控制复杂（过膜压力，切向流流速）•用于培养液收集，样品浓缩以及交换缓冲液•较高的膜载量CrossFlowPermeateFlowFlowPressureTime中空纤维的组成中空纤维切向流过滤装置示意图膜分离技术的基本概念切向流过滤技术的优化中空纤维的应用举例中空纤维膜分离产品总结内容膜孔径大小的优化选择Rejection%MembraneRejectionCurvesDiffusiveSharp110100NMWC(KD)0100Ideal•样品透过:膜孔径至少为目标分子量的5-10倍以上-(CHO细胞培养液澄清过滤,e.g.0.2-0.45μmHF抗体)•样品截留:膜孔径大小应该为目标分子量的1/3-1/5-(蛋白浓缩/缓冲液置换,e.g.50-100kDMW抗体的浓缩)•两种物质需要用膜技术分开,分子量10倍的差异.膜孔径选择基本原则TMP(tans-membranepressure)透膜压力=(PF+PR)/2-PPTMP∝Flux(一定范围内正相关，LMH)DeltaP=PF-PRDeltaP∝Crossflow（循环流速）∝剪切力（shearrate）入口端Feed回流端Retentate透过端切向流过滤参数的优化超滤过程的优化超滤应用：•浓缩/换液•除去小分子•部分用于收集细胞以及菌体OptimalTMP最佳透膜压力TMP(psi)FiltrateFlux(LMH)MembraneControlRegionGelLayerControlRegionWaterSampleSolutionOptimaTMPRegionTMP优化TMPPermeateFluxHigherCrossflowOptimalTMPLowerCrossflowOptimalTMP微滤过程的优化微滤应用：•除菌／除颗粒•发酵液培养液澄清•连续细胞培养灌注•菌体／细胞/澄清/收集/分离/去除透过端控制(PFC,permeateflowcontrol)1psiPPPPPP6psi2psiClarifiedcultureCrudecultureTimePermeateFluxUnrestrictedPermeateFlowPermeateFlowControl(PFC)AllowsforPFCandasteadierfluxPFCvsUnrestrictPermeateFlowPFC洗滤过程的优化优化洗滤方法直接稀释法间断稀释法连续流稀释法洗滤方法的选择0.010.020.030.040.050.060.070.080.090.0100.0012345678910DiafiltrationVolume(DV)BufferConcentration(%)dilutionDiscoontinousContinuous中空纤维膜的清洗化学试剂:以NaOH试剂为主（0.1-1MNaOH）适当添加部分清洗剂清洗时间:30min--2hr清洗温度:25oC--50oC,更高的温度可以更容易去除污染物中的一些脂蛋白循环流速度:等同或者超过操作的循环流速的50%膜清洗结果例证CleaningMethodsWaterFluxRecovery0.5MNaOHfor30minatroomtemperature62%1MNaOHfor2hrsat50oC65%0.5MNaOH-300ppmNaOClfor30minatroomtemperature80%0.5MNaOHfor30minatroomtemperaturethen0.5MH2SO4for30minatroomtemperature84%0.5MNaOH-500ppmNaOClfor30minatroomtemperature90%Double0.5MNaOH-300ppmNaOClfor30minatroomtemperature~100%Challengeproteinsolutionusedforthisstudy:0.5%or1%BSA中空纤维膜的保存PESandPS膜:用NaOH溶液,避免用有机溶剂,比如EtOH等醋酸纤维素膜:用20%EtOH，避免用NaOH长时间储存:推荐冷库保存StorageSolutionsConcentrationsMax.StorageTimeWater1-3daysNaOH@RT0.1M3monthsNaOH@4oC0.05-0.1M1year膜分离技术的基本概念切向流过滤技术的优化中空纤维的应用举例中空纤维膜分离产品总结内容中空纤维的应用菌体收集、菌体裂解液澄清高固含量料液的固液分离纯化的蛋白发酵菌体收集/清洗细胞破碎/裂解裂解液澄清层析纯化……胞内可溶蛋白的纯化培养基去除/浓缩细胞碎片去除菌体收集:酵母,E.Coli,Insectcell等750kD/0.1µm中空纤维特点：开放式孔道可处理较脏的料液不需要离心/预过滤设备投资少，步骤简单快速完全代替离心机寿命长，成本低易于线性放大PPPPPP10psi5psi发酵液菌体收集(胞内蛋白、质粒)包涵体收集(重组蛋白)硫酸铵沉淀收集(重组蛋白)菌体裂解液澄清•可以截留住细胞以及细胞碎片,蛋白可以顺利透过膜•膜孔径选择750k/0.1µm/0.2µmPPPPPP6psi1psi发酵液2psiA.胞内可溶蛋白HFUFP缓冲液置换B.包涵体收集(重组蛋白)硫酸铵蛋白沉淀HF沉淀收集戊二醛解毒HFUFP去除戊二醛HF缓冲液置换HF柱上复性中空纤维的应用细胞培养液澄清(MAbs)抗体整体下游分离过程高密度细胞培养液中空纤维微滤一步澄清MabSelectSure捕获病毒灭活与去除CaptoAdhere精细纯化50kD膜包浓缩/洗滤（换缓冲液）0.2µmNFF除菌过滤注射用抗体中空纤维一步澄清•开放式结构可直接处理细胞培养液，无需预处理•低剪切力防止聚集•高载量可重复使用，成本低•可在位清洗防止污染•线性放大FeedRetentatePermeateMembrane0.2/0.45µmPPPPPP6psi2psiClarifiedcultureCrudeculturePFC膜孔径选择结果CrossFlowPermeateFlow洗滤体积的选择651563.52.51.592642511521050153045607590105120permeateDV1DV2DV3DV4DV5Permeate+DV1-4poolRecovery%Exp2Exp1中空纤维的应用浓缩、洗滤(Vaccine)经典应用案例：•750kDHF狂犬疫苗浓缩/洗滤•750kDHF流感疫苗浓缩/洗滤•50kD流脑多糖疫苗浓缩/洗滤•300kDHF腺病毒的浓缩/洗滤•300kDHF乙肝疫苗浓缩/洗滤•300kDHFDNA疫苗浓缩/洗滤纯化的病毒疫苗传代Vero或BHK21细胞培养/原代地鼠肾细胞1-2µm死端过滤（澄清）750kD浓缩（浓缩50-100倍/洗滤）4FF/6FF凝胶过滤（精纯）QSepharoseFF离子交换（穿透式，可选）750kD膜超滤浓缩通用病毒疫苗生产工艺（狂犬、流感等）Formulation流脑多糖疫苗浓缩FlexStand中试规模：UFP-50-E-6A,0.28m2HF50kS_30kCassettemg唾液酸/g粗糖(400)437440Flux通量(LMH)3325处理量(L/m2)8933mg核酸/g粗糖(20-30)1013EU内毒素/g粗糖(300)228249CWFrecovery95%ND括号内为IPC内控指标W群流脑多糖疫苗超螺旋质粒DNA疫苗纯化FermentationFormulation750KHFcellharvestingLysisCheesecloth20umNFF300kHFconcentrationPlasmidSelectXtrasupercoiledplasmidDNAcaptureSepharose6FFRNA-removalSource30Qpolishing300KHFconcentration中空纤维的应用细胞灌注培养中空纤维膜进行连续灌注培养FeedpressureOutletorretentatepressureFiltrate,permeate,orultrafiltratePumpFreshmediaorairRetentatereturnorrecyclestreamcarriesretentate,concentrateorrejects.BioreactorUltrafiltrationormicrofiltrationCartridgeBackpressurevalveFeedThepermeateortheretentatemaybetheproduct.膜分离技术的基本概念切向流过滤技术的优化中空纤维的应用举例中空纤维膜分离产品总结内容GE可提供种类最全的中空纤维产品•超滤：1KD;3KD;5KD;10KD;30KD;50KD;100KD;300KD;500KD;750KD•微滤:0.1mm;0.2mm;0.45mm;and0.65mm•纤维管内径:0.25mm;0.5mm;0.75mm;1.0mm;1.75mm;2.0mm;and3.0mm•单根滤柱膜面积：16cm2-28m2•Autoclave&Steam-online高压灭菌&在线蒸汽灭菌可选FeedRetentatePermeateMembrane中空纤维手动系统MidJetQuixStandFlexStandGrandStandCustomizedDesign中空纤维全自动系统UniFluxÄKTAcrossflow膜分离技术的基本概念切向流过滤技术的优化中空纤维的应用举例中空纤维膜分离产品总结内容总结总结-“活性”:永恒的话题！-中空纤维低剪切力最大程度保护生物大分子的活性收率-开放式流道-轻松处理高固含量/高黏度料液而不堵塞-极佳的物理/化学耐受性-易于清洗,寿命长,成本低-直接线性放大-大量成功的范例,广泛用于生物制药各个领域Q&A