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2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。5．II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7．KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。因为一个平头末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平头末端的3’羟基或5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平头末端的连接速度比粘性末端慢10-100倍。11．为什么外源DNA难以转化野生型的微生物受体细胞野生型细菌有针对外源DNA的限制和修饰系统，外源DNA会被识别，从而被降解，要选择限制系统缺陷型的受体细胞（限制缺陷型）；外源基因克隆、扩增以及表达是建立在DNA重组分子自主复制的基础上的，受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的受体细胞（重组缺陷型）；用于基因工程的受体细胞必须对重组DNA分子具有较高的可转化性，利用遗传诱变技术改变受体细胞壁的通透性，从而提高其转化率（转化亲和型）13．简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略载体遗传标记检测：抗药性检测，营养缺陷型检测；显色筛选克隆DNA序列检测：限制性酶切图谱法，菌落原位杂交法，PCR扩增法14．探针、引物、接头的物质基础和用途分别是探针:小段单链DNA或RNA,序列可以是已知的或未知的，带有标记（放射性/非放射性），用于检测与其互补的核酸序列；引物：小段单链DNA或RNA，序列是已知的，长度为16-30bp，作为DNA复制的起点接头：平头双链DNA，更换粘性末端15．简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNA片段，分别连接到载体DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含有目的基因的期望重组子。为保证覆盖整个基因组，需要测远远超过基因组大小的序列；适合较小的基因组；测序后需要填补一些空白；适合没有重复序列的基因组，如果有大量的重复序列，不能保证正确的组装。cDNA法：获得mRNA，除去内含子PCR法，知道基因的两侧序列或中间序列化学合成法，知道全基因序列，小片段连接法，补丁延长法，大片段酶促法16．简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。基因文库：基因组文库和cDNA文库基因组文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。cDNA文库：由某个生物体的某个器官或组织mRNA反转录形成的总cDNA，构建形成的基因文库一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。构建技术：载体：λ-DNA和考斯质粒，装载量大（待克隆DNA随机片段的大小应与所选用的载体装载量匹配）用机械断裂（超声波冲击）或限制性内切酶部分酶解整个基因组DNA，得到大量的DNA片段，将这些片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。cDNA构建技术：载体：普通质粒（表达型），受体细胞：大肠杆菌（繁殖迅速，易于保存，克隆操作简便，转化效率高）提取细胞内总RNA，用Oligo(dT)探针分离其中的mRNA，经反转录形成cDNA，将单链cDNA变成双链，用合适的限制性内切酶进行酶切，与载体相连，转化宿主菌，挑选阳性克隆，形成文库第三章1、简述外源基因在大肠杆菌中高效表达的基本原理。强化蛋白质生物合成，抑制蛋白产物降解，维持或恢复蛋白质特异性空间构象启动子：选用强启动子，-10区和-35区两个六聚体盒的碱基组成以及彼此的间隔长度（17bp），可控性启动子（Lac启动子）终止子：强终止子，rrnT1T2，否则会形成长短不一的mRNA混合物SD序列：5’-UAAGGAGG-3',考虑SD序列与翻译起始密码子之间的碱基组成密码子：更换外源基因中不适宜的相应密码子；将与外源基因密码子相关的tRNA编码基因同步克隆。将外源基因至于这个可控的基因框架内5、简述外源基因在大肠杆菌中几种主要的表达方式及其优缺点。包含体型异源蛋白的表达：优点：1.简化外源基因表达产物的分离操作-离心,2.能在一定程度上保持表达产物的结构稳定----蛋白酶不再构成威胁缺点：包含体中的蛋白质中的氨基酸序列不具备正确的折叠结构，无活性分泌型异源蛋白的表达：a)通过蛋白质N端信号肽将蛋白质通过运输或分泌的方式定位在细胞周质（内膜与外膜之间的空隙）或直接分泌到培养基中的，称为分泌蛋白b)一些蛋白分泌到胞外，会增加其稳定性c)将大肠杆菌分泌型蛋白的信号肽与外源基因相连，转化分泌型受体细胞，则可获得分泌在培养基中的重组异源蛋白。缺点：表达率要比包含体方式低很多，且大肠杆菌对真核生物的蛋白质分泌机制不健全，难以表达。融合型异源蛋白表达：a)外源基因+受体菌自身蛋白基因→融合基因→表达融合蛋白（內源基因N端，外源基因C端）b)优点：1）增加了稳定性2）便于体外纯化3）表达效率高缺点：目的蛋白需要回收（需要裂解和进一步分离才能获得目的蛋白，还需要回收，成本较高）10、简述大肠杆菌工程菌遗传不稳定性的主要表现形式及解决途径a)不稳定主要两种形式i.重组DNA分子发生缺失、重排或修饰ii.重组分子从受体细胞中逃逸b)不稳定的机制：i.细菌的限制和修饰系统ii.高效表达的重组蛋白，抑制细菌正常生长，诱导细菌产生应激反应。iii.不均匀分配iv.转座元件导致重组分子重排c)对策1、改进宿主系统2、施加选择压力3、控制外源基因表达量4、优化培养条件第四章1、与大肠杆菌相比酵母作为基因工程受体的主要优势是什么？基因表达调控机制比较清楚，且遗传操作相对较为简单；具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含特异性病毒，不产生毒素，安全；能将外源基因表达产物分泌至培养基；酵母是最简单的真核生物，利用酵母表达动植物基因，能在相当大程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系。4、酵母人造染色体作为载体的主要用途是什么？克隆扩增大片段的外源DNA；克隆的DNA片段可通过整合型YAC直接定点整合在酵母基因组中，进而研究克隆基因的生物功能。6、简述几种主要的酵母启动子可控性表达系统。温度控制表达系统：酿酒酵母的PHO5基因通常在培养基中磷酸盐耗尽时被诱导高效表达，PHO4基因的编码产物是PHO5基因表达的正调控因子。利用温度敏感突变基因pho4ts的编码产物在35℃时失活，因此含有pho4ts-PHO5型启动子的克隆菌在35℃时能正常生长，但不表达外源基因，温度降低到23℃时，pho4ts基因表达的正调控因子促进PHO5启动子的转录活性，进而诱导其下游外源基因的表达。（特点：低温诱导，磷酸盐抑制）超诱导表达系统：利用酵母的半乳糖基因的启动子当酿酒酵母生长在无半乳糖或葡萄糖存在的培养基时，GAL1,GAL7,GAL10启动子受到阻遏；加入半乳糖或葡萄糖耗尽时，启动子被诱导1000倍。GAL10编码一种正调控蛋白，能与GAL1,GAL7,GAL10启动子上游的UAS特异性结合。将野生型的GAL4基因置于GAL10启动子的控制之下，并将这个基因的表达序列整合在酿酒酵母的染色体DNA上，将外源基因置于另一GAL启动子的调控下。8、简述表达乙肝疫苗的重组酵母的构建程序将HBsAg的编码序列和用于选择标记的巴斯德毕赤酵母组氨醇脱氢酶基因PHIS4插入到甲醇可诱导型的AOX1启动子和AOX1终止子之间，构成环状重组质粒pBSAG151。用BgIII打开pBSAG151，使得AOX1启动子和AOX1终止子分别位于线型DNA片段的两端，并转化HIS-的受体细胞。在HIS+的转化子中，重组DNA片段与受体染色体DNA上的AOX1基因发生同源交换，单拷贝的HBsAg编码序列稳定地整合在染色体上，用甲醇诱导HBsAg的表达，形成类似病毒携带者的22um颗粒。第五章4、工程胚胎干细胞法和体细胞转基因克隆法的主要区别？ES细胞能在培养基中生长，是保持分化能力的胚性细胞。整合了外源基因的ES细胞能够输入到胚泡细胞，最终形成转基因动物个体。ES细胞的基因寻靶：用外源DNA替换内源的序列，对选定的基因进行定点突变。大多数基因寻靶试验是用以打断内源基因位点，以形成定向的无效等位基因（基因敲除）体细胞克隆：受体动物选择TK-或者DHFR-，与带有转基因的重组载体建立遗传互补，不能作为永生细胞存在，需不断进行体外培养。寻靶载体的设计特化的质粒载体，导入ES细胞后可以促进同源重组大多数基因寻靶试验是用以打断内源基因位点，以形成定向的无效等位基因（基因敲除）插入载体在同源区内线性化，使整个载体插入目的基因位点,打断了目的基因，但也会使选择标记附近的序列重复..替换载体使同源区域目的基因共线性.转染前在同源区外切割载体，成线性。交换会使内源DNA被导入的DNA替换.第六章4、简述Ti质粒介导的二元整合转化战略的基本过程Ti质粒转移区(TDNA）：参与在不同农杆菌中的接合转移毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体二元载体：构建含T-DNA区的根瘤农杆菌-大肠杆菌穿梭质粒，将外源基因，NPTII和多克隆位点取代T-DNA上的tms,tmr和tmt基因组，重组分子转化大肠杆菌，鉴定扩增后再导入携带一个Ti辅助质粒的根瘤农杆菌中，该辅助质粒含有vir区但缺失了T-DNA区；将上述的根瘤农杆菌转化子悬浮液涂布在植物根部愈伤组织中，辅助质粒中的vir基因表达产物便会促使重组T-DNA片段进入受体细胞。工程胚胎干细胞ES细胞：能在培养基中生长，保持分化能力的胚性细胞。整合了外源基因的ES细胞能够输入到胚泡细胞，最终形成转基因动物个体。ES细胞整合外源基因的载体A、非特异性整合及PCR鉴定B、特异性整合及PCR鉴定ES细胞的基因寻靶用外源DNA替换内源的序列，对选定的基因进行定点突变突变