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抗生素产生菌获得和初筛一：实验目的学习从土壤中分离微生物的方法学习采集样品和制备培养基学习无菌操作技术二：实验原理自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）放线菌（107）霉菌（106）酵母菌（105）藻类（104）原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数同时也可以从其他微生物富集地方（医院附近，废水等）采集样品。抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。本实验采用的抗生素为β-内酰胺类——青霉素类和）四环素类——土霉素。青霉素属于青霉素类抗生素，干扰细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用；土霉素属于四环素类抗生素，作用于病原微生体核糖体30S亚基，抑制肽链的增长，影响细菌或微生物的蛋白质合成。重铬酸钾可作为比较理想的放线菌分离抑制剂。根据目标菌落出现数量和抑制剂的价格成本,重铬酸钾是一种理想的放线菌分离抑制剂,它具有3个显著特点:①可抑制土壤中细菌和真菌的生长;②不影响放线菌的正常生长,有时还可刺激一些放线菌的生长;③价格低廉,在进行土壤放线菌大量分离工作中可推广使用。高氏一号培养基适合放线菌生长。三：实验材料四：实验内容1.培养基配制高氏一号改良培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，琼脂20g，水1000ml，终浓度为50×10-5重铬酸钾，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。冷却后，倒制平板数个。初筛培养基：改良高氏一号培养基（在原来配置的高氏一号琼脂培养基灭菌后，再分别加入青霉素终浓度为10-5，10-4，10-3的药剂），倒制平板数个2.样品采集分别从土壤中（将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好，给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡），废水（分别取流动处和静止处，并记录相关数据）3制备稀释液：（1）.称取土壤1g（或量取1nl水样），放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－2的土壤悬液。（2）.另取装有无菌试管5支，用记号笔编上10－3、10－4、10－5、10－6、10－7。在每只试管中用无菌吸管加入4.5ml无菌水。（3）.取已稀释成10－2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取0.5mL土壤悬液加入10－3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4→10-5→10-6土壤稀释液。在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀释方法见图（1）4：平板涂抹：取无菌培养皿，将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。（图2）5：培养：将接种后的培养基静置10min后，倒置于28～30℃条件下培养3～4d，计数菌落，并计算出每g土壤中放线菌的数量。（每毫升样品中微生物细胞数=每皿菌落平均数*稀释倍数*1/取样体积数）6：初筛：选取菌落生长良好，排布均匀的培养基，用接种环分别均匀（3至5处）挑取培养基中的菌落，在无菌条件下分别接种于初筛培养基中，倒置于28～30℃条件下培养3～4d。抗生素产生菌复筛一：实验目的1.掌握紫外光谱定性检测青霉素的方法2.了解青霉素的抗菌谱二实验原理青霉素是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，青霉素在氢氧化钠介质中水解为具有还原性的青霉素噻唑酸后，在沸水加热的条件下，于0.24mol/L硫酸介质中，利用磷钼酸被还原为钼兰的水相显色反应，在720nm处测定其吸光值。青霉素为β内酰胺抗生素对革兰阳性菌及某些革兰阴性菌有较强的抗菌作用，金黄色葡萄球菌(金葡菌)、肺炎球菌、淋球菌及链球菌等对本品高度敏感；脑膜炎双球菌、白喉杆菌、破伤风杆菌及梅毒螺旋体也很敏感青霉素高活性的β-内酰胺环与敏感细菌胞浆膜上靶分子青霉素酶结合蛋白（penicillinbindingprotein,PBPs）结合，呈现抑制转肽酶的转肽作用，阻碍黏肽合成的交叉联结过程，造成细胞壁缺损，由于敏感菌体内渗透压高，使水分不断内渗以至菌体膨胀，促使细菌裂解而死。三：实验材料四：实验内容青霉素产出定性检测1.培养基配制发酵培养基：10%葡萄糖，%-5%麸皮，0.5%-0.8%苯乙酸，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，水1000mlpH6.4~6.8。分装入三角瓶中，112℃灭菌20分钟。2.青霉素标液制备准确称取注射用青霉素钾0.2009g无菌水中，然后移入250ml容量瓶中，无菌水定容至刻度，即得每毫升含0.8162毫克的青霉素标准溶液。2.接种选取经初筛后，生长状态良好的单菌落，在无菌条件下，用接种环挑取菌落接种于发酵培养基中，于25℃培养24h。3.纯培养菌落获得：取经过24h发酵后的生长状态良好的菌株，接种到高氏一号改良培养基中保存。青霉素定性检测标准样品制备：吸取青霉素标准溶液1ml于试管中，加入0.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5％钼酸铵2.0ml，8％Na2HPO41.0ml，加入发酵培养基至20ml，摇匀，于沸水中加热20min。取出冷却，摇匀。试验品制备：取出0.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5％钼酸铵2.0ml，8％Na2HPO41.0ml于试管中，标号。加入经过发酵后的发酵培养基至20ml，摇匀，于沸水中加热20min。取出冷却，摇匀。空白样品制备：取出加入0.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5％钼酸铵2.0ml，8％Na2HPO41.0ml，加入发酵培养基至20ml，摇匀，于沸水中加热20min。取出冷却，摇匀。分光检测：分别以空白样品和标准样品作为对照，在720nm处测定吸光度。青霉素抗菌谱检测1.培养基配制：高氏一号筛选培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。冷却后，向其中加入经发酵培养后的培养液10ml，摇匀，倒制平板数个。2.敏感菌种接种：在无菌条件下.用接种针（环）将大肠杆菌，葡萄球菌，乳酸菌，酵母菌，短小芽孢杆菌（根据实验室条件）分别用划线法接种在高氏一号筛选培养基中，记号。于28~30℃培养3-4d。3.结果观察:观察在实验条件下培养下，敏感菌生长状态。抗生素产生菌鉴定一：实验目的1.掌握放线菌鉴定的方法。2.学会使用《伯杰细菌手册》二：实验原理根据放线菌在特定培养基中培养时生长的形态，菌落特征。以及通过对放线菌进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色并观察其运动性，测试其生理生化反应，然后根据实验结果对照《伯杰细菌手册》判断试验中所能够产生抗生素的放线菌的属（类）三：实验材料四：实验内容菌体特征的观察培养基配制：LB固态培养基：950ml去离子水中加入:蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g待溶质溶解.琼脂20g，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.120℃蒸汽灭菌20min冷却后倒制平板。PDA固态培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15~20克，自来水1000毫升，自然PH，.120℃蒸汽灭菌20min冷却后倒制平板。LB液体培养基和PDA液体培养基除琼脂外，成分同上接种培养：分别在LB、PDA平板上划线接种,28℃培养24～48h。分别在LB、PDA液体培养基上接种,28℃摇床振荡(180r/min)培养24～48h。2.菌体形态观察2.1革兰氏染色1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染1分钟。3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。2.2芽孢染色1）将培养的复筛放线菌作涂片、干燥、固定。（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色2.3荚膜染色（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（3）染色：在涂面上加复红染色液染色3—5min。（4）水洗：用水洗去复红染液。（5）干燥：将染色片放空气中晾干。（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴苯胺黑，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触苯胺黑，使苯胺黑沿玻片后缘散开（夹角30度），然后推向另一侧，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。2.4鞭毛染色A液：a.5%石炭酸10mlb.鞣酸2gc.饱和硫酸钾铝10mlB液：结晶紫酒精饱和溶液。应用液：A液10份，B液1份，混合过滤后室温存放a.使用新的载片,因含游离碱较多，所以要用2％盐酸浸泡几小时，用自来水冲洗干净，然后再用蒸馏水洗净，沥干后放于95％乙醇中浸泡24后，取出后烧去酒精，即可使用。b.一张玻片滴蒸馏水2滴，（制两个涂片）；c.取幼龄菌菌落少许，将细菌点在玻片上蒸馏水顶部，不要搅动，以免鞭毛脱落，使其自然扩散；d.室温自然干燥。e.把10份A液与1份B液混合过滤后，取染液覆盖于菌膜上，染色15min以上，蒸馏水缓缓冲去染液；f.自然干燥后镜检。镜检时应注意从边缘开始，逐渐向中心移位。染色结果：菌体和鞭毛均呈紫色，鞭毛的着色较菌体淡。3.菌体生理生化实验3.1糖(醇)类发酵试验葡萄糖发酵培养基（O/F）成份：蛋白胨2．7克氯化钠5．0克0．2%溴麝香酚兰0．03克琼脂3克，KH2PO40．3克葡萄糖10．0克，水1000毫升，溶解调PH7．110℃高压灭菌20分钟后，冷却倒板待用。步骤：接种将待鉴定的菌种接种到葡萄糖发酵培养基，置37℃温箱中培养24h。观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色)，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基显酸色反应，。若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。3.2甲基红(Methylred)试验葡萄糖蛋白胨水培养基成份:葡萄糖0.5g蛋白胨0.5gK2HPO40.2g水100mlpH7.2-7.4110℃高压灭菌20分钟后，冷却倒板待用。将待鉴定放线菌接种到葡萄糖