色谱柱选择与维护

色谱柱的选择与维护魏少勇[e-mail]15920467889广州菲罗门科学仪器有限公司色谱柱的选择与维护公司简介如何选择色谱柱A、固定相的选择B、PH的选择如何维护色谱柱广州菲罗门科学仪器有限公司中国全权总代理广州菲罗门科学仪器有限公司广州菲罗门科学仪器有限公司我们的宗旨:以最真诚和迅速的态度替用户提供优质服务,解决分析的问题和需要•1982成立于美国加州•提供一系列非常完整的色谱柱•极少数专门提供色谱耗材公司-液相和气相•免费提供超过10000应用谱图•免费提供技术支持•免费提供技术资料2004LabvisionHPLCColumnReport•2004年一月到六月Labvision调查美国1200实验室结果•使用柱子数量的比例•Phenomenex25%•W22.5%•A7.7%•S7.6%•其他5%以下如何选择适当的色谱柱理想的柱子•可以适用于分析所有的化合物•永远不会坏•理想分离度决定峰分离度的三个要素•峰保留时间•选择性(出峰的顺序)•柱效如何得到最理想的分析结果流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好,但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果,可以改变下列的一项或数项条件:流动相固定相pH温度固定相的选择•疏水性的选择•极性的选择•苯基的选择固定相疏水性考虑的要素•键合相的种类(C18,C8,Phenyl,etc)•表面积•键合相的键合率Luna™C18(2)–月神•品质可靠,世界畅销的C18柱•重复性高–可以同时提供3个不同的批次的柱子Luna™C18(2)GinsengRootColumn:Luna5µmC18/ODS(2)Dimensions:150x4.6mmIDElutionType:GradientEluentA:Acetonitrile/water(15:85)EluentB:Acetonitrile/water(80:20)FlowRate:1.5mL/minTemperature:25°CDetection:UV-VisAbs.–VariableWave.@205nmAppID1125Luna™C8(2)&C5•减少疏水性化合物的保留时间•减少分析的时间Synergi™Max-RP•疏水性和C18柱类似–但这是一支C12柱•提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合物Synergi™Max-RPBasicDrugsatNeutralpH疏水性的比较0.0002.0004.0006.0008.00010.000kbutylbenzeneSynergiHydro-RPLunaC18(2)SynergiMax-RPLunaC8(2)LunaC5LunaPhe-HexJupiterC18SynergiPolar-RPProdigyPhenylJupiterC4LunaCyanoLunaAminoC18phasesC8phase300ÅC18phase极性选择性的考虑首先考虑•固定相的极性封尾,封端基团•分析物的极性官能基之间的作用极性选择性如何增加极性的选择性•极性基团封端•极性基团镶嵌•苯基极性选择性Columns:Luna™5mC18(2)YMC-Pack™5mProC18Synergi™4mPolar-RP®(Ether-linkedPhenyl)150x4.6mmMobilephase:75:25Methanol:waterFlowrate:1mL/minComponents:1.Estrone2.EstradiolOHHHOHCH3HEstradiolOHHHOCH3HEstrone极性选择性min12345mAU0255075100125150175min12345mAU0255075100125150175200min12345mAU020406080100Luna™C18(2)Synergi™Polar-RP®YMC-Pack™ProC181+21+212OHHHOHCH3HEstradiolOHHHOCH3HEstroneSynergiMax-RP-C12SynergiHydro-RP-C18SynergiFusion-RP–C18SynergiPolar-RP–PhenylSynergi™SilicaAdvantageBalancingEfficiency&BackpressureLinearVelocity(mm/sec)PlateHeight(H)5µ4µ3µFlowRate(mL/min)PressureDrop(Bar)higherefficiencieslowerbackpressuresSynergi™Synergi™Synergi™Max-RP与C18柱性能类似的C12柱Synergi™Polar-RP®•保留极性和苯基化合物•100%水溶液稳定•增加极性的选择性Synergi™Hydro-RP•疏水性非常强..•极性封端100%水溶性稳定•增进极性的选择性SynergiHydro-RPVS.Luna®C18(2)Synergi™Hydro-RPSynergiHydro-RPSynergiMax-RPMobilePhase:A:20mMKH2PO4,pH4.6B:AcetonitrileGradient:A/B(95:5)toA/B(65:35)in15minFlowrate:1.5mL/minSample:1.Morphine2.Hydromorphone3.Codeine4.Nalorphine5.OxycodoneSynergi™Hydro-RPSynergi™Fusion-RP•增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间•在水溶液中100%稳定•在LC-MS下面基本无流失min02468101214mAU0100200300400500VWD1A,Wavelength=210nm(S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\TEST0034.D)min02468101214mAU050100150200250300350VWD1A,Wavelength=210nm(S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\FUSI0046.D)RunningConditionsMobilephase:75:2520mMPotassiumphosphatepH2.5:AcetonitrileFlowrate:1.5ml/minTemperature:AmbientDetection:210nmInjection:1.Maleicacid2.Chlorpheniramine3.Triprolidine4.DiphenhydramineSynergiFusion-RP480Å一般的C18柱极性增大疏水性减少min02468101214mAU020406080VWD1A,Wavelength=230nm(F:\PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW0503\CARLO071.D)min02468101214mAU020406080VWD1A,Wavelength=230nm(F:\PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW0503\CARLO087.D)min02468101214mAU020406080VWD1A,Wavelength=230nm(F:\PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW0503\CARLO088.D)SynergiFusion-RPAvgsymm:0.91SynergiMax-RPAvgsymm:0.77LunaC18(2)Avgsymm:0.82RunningConditionsMobilephase:A:25mMTrispH9B:ACNGradient:40%-70%Bin15minutesFlowrate:1.0ml/minDetection:230nmComponents:1.Scopolamine,LogP=2.Lidocaine,LogP=2.443.Noscapine,LogP=1.97NOCH3OOOHOONOOHHOOO苯基的选择性影响•被分析物和固定相之间产生的作用SiCH3CH3OSiOSiOOSiOOHOHLuna™Phenyl-Hexyl•使用甲醇可以增加作用效果Luna™Phenyl-Hexyl•具有疏水性和苯基双重的选择性•重复性高和稳定的苯基固定相Luna™Phenyl-HexylGreenTea(绿茶)Column:Luna™5uPhenyl-HexylDimensions:250x4.6mmMobilePhaseA:0.2%AceticacidinWater/Acetonitrile(91:9)B:Water/Acetonitrile(20:80)Gradient:100%Atot=25min,(68:32)t=25mintot=35min,hold100%Bfor10min.FlowRate:1ml/minTemperature:350CAppID14436苯基的影响Columns:Luna™5mC18(2)150x4.6mmLuna™5mPhenyl-Hexyl150x4.6mmSynergi™4mPolar-RP150x4.6mmMobilephase:50:50Acetonitrile:20mMPotassiumphosphatepH2.5Flowrate:1.0mL/minComponents:Acidic,aromaticcompounds1.Indoprofen2.Ethylparaben3.Naproxen4.Diflunisal5.Indomethacin6.Ibuprofenmin1234567mAU050100150200250min1234567mAU020406080100120140min1234567mAU020406080100120140•C18(2)•Phenyl-Hexyl•Polar-RP苯基的影响pH的影响当选择流动相的pH时,我们必需考虑到pH对分析物和柱子两者的影响pH对柱子的影响即使键合完美,封端完好,硅胶表面还是会存在Si-O-H的微酸游离基pKa~3.5如果流动相的pH是4以上,此Si-O-H的游离基会脱氢,成为带负电的Si-O-(这会造成和分析物之间的极性反应,而造成峰拖尾)如果流动相的pH是8(或10)以上,硅胶会被破坏,造成柱子损害pH对分析物的影响基本上,反相柱的峰保留时间长短,主要归因于疏水性的非极性反应.所以要增长峰保留时间,必需选择流动相的pH能够让分析物保持中性对酸性分析物(pKa~3-6),基本选择pH在pKa以下对碱性分析物(pKa~9-11),基本选择pH在pKa以上对碱性分析物的分析建议多数硅胶柱没法于高pH条件下稳定,所以一般分析碱性化合物时,会选择于pH~1.5-3下进行分析.在此pH条件下,硅胶表面的游离Si-O-H会保持中性,减少离子间的二极反应,因而减少峰拖尾,峰型较好但是在低pH条件下,碱性化合物的极性增加,疏水性减少,如果要增加峰保留时间,流动相的有机溶剂比率必需减少对碱性分析物的分析建议在高pH条件下,碱性化合物可以保持中性,疏水性因而增加,但是如果峰保留时间太长,可以将流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间.增加选择分析条件的弹性流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间外,并可以增进峰型(尖)但是问题是:如何在高pH(8以上)条件下分析?高pH对碱性分析物的分析选择使用高分子柱使用最新技术突破的双子星柱(GEMINI)Gemini™C18–双子星柱Gemini™C18–双子星柱•在pH1-12范围内很稳定•适用于酸,中,碱性化合物,特别是分析中,碱性化合物很理想•可以更有弹性的调节pH以得到合适的分析条件ParticleTechnology•Polymer•Silica•TwinGemini™C18流动相pH的影响pH1–12StabilityGemini™C18p