科研平台与科研方法

检验平台对科研的支撑作用科研模式人体器官组织细胞蛋白RNADNA转录因子转录反转录合成信号通路调控动物动物器官组织细胞蛋白RNADNA转录因子转录反转录合成信号通路调控检验支撑平台一、核酸提取平台二、核酸检测平台（一）微量核酸、蛋白定量仪（二）PCR(聚合酶链式反应)扩增PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链.这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子.如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍。（三）DNA重组与分子克隆1、目的基因的获取2、克隆载体的选择与改建3、外源基因与载体的连接4、重组DNA导入受体细胞大肠杆菌6、重组体的复制7、目的基因提取、纯化5、重组体的筛选细菌培养破坏细菌，提取DNA，电泳DNA分子克隆过程8、电泳（四）荧光定量PCR（五）电泳050010001500200025003000BEBE+LPSBE+TNFBE+PAFBE+IL-18BE+EOTIL-6(pg/ml)P=0.006**P=0.014*P=0.199BE:BEAS-2Bcellβ-actinIL-6（六）基因芯片BEBE+TNFICAM1BE+TNFBEβ-actinControlTNF-αICAM-1BE:BEAS-2BcellBE+EOSBE+EOS+LPSBE+EOS+TNFControlIL-8IL-8IL-8IL-8IL-6IL-6IL-6IL-6BE（七）DNA倍体分析S期细胞,DNA含量开始增加,2CG0/G1期DNA含量为2C1、正常细胞DNA含量2C水平2、性细胞DNA含量为1C3、处于增殖期至分裂期细胞由2C增加至4C4、凋亡细胞DNA断裂,2CM期DNA含量为4CDNA倍体分析在肿瘤诊断中应用基础健康人体中大部分细胞为相对静止细胞—2C细胞。肿瘤细胞的发生是由于内、外环境改变后细胞分裂加快，结果导致机体细胞中异倍体细胞、非整倍体细胞增加。G0-G1SG2-MFluorescenceIntensity(DNAcontent)Events2C4C（三）结果（直方图）0102030405060708011.50.50543214.53.52.5一例正常宫颈上皮DNA-ICM分析图形。宫颈上皮细胞为DNA整倍体。左上图为直方图，Y轴为细胞的数量，X轴为DNA含量（DNA指数）。可见大多数细胞分布在DI为1的部位，少数细胞在DI为2的部位。左下图为DNA含量与细胞核面积分布图，宫颈细胞核由Feulgen染色，Y轴是表示细胞核的面积的大小，以像素表示（1个像素为0.1μm2）。X轴是DNA含量（DNA指数）。正常细胞DNA含量示意图：0102030405060708011.50.50543214.53.52.5一例增生的宫颈上皮DNA-ICM分析图形。宫颈上皮细胞为DNA多倍体。左上图为直方图，大多细胞分布在DI为1的部位，少数细胞在DI为2和4的部位。左下图为DNA含量与细胞核面积的分布图多倍体细胞肿瘤转移性腺癌心包积液（八）基因测序分析Illumina/SolexaGenomeAnalyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。（九）质谱基因测序分析三、蛋白质分析检测平台（一）考马斯亮蓝（二）电泳1、醋纤薄膜电泳2、凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶电泳（2）聚丙酰胺凝胶电泳（3）双向电泳（2－DE）第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即利用蛋白质的分子量（Mr,相对分子量）差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。（5）毛细管电泳（6）免疫固定电泳一种用于分析样品中特异性抗原的技术。即将蛋白质混合物在固相载体上进行区带电泳，再与特异性抗体反应，从而检出与抗体结合的相应抗原。（7）等电聚焦电泳3、酶联免疫吸附实验(ELISA)它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。①将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；②加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，然后把多余抗体洗除；③加入与待测抗原呈特异反映的酶联抗体（二抗），使形成“夹心”；④加入该酶的底物，若看到有色的酶解产物产生，说明在孔壁上存在相应的抗原。酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)4、免疫印迹(Westernblot)细胞内细胞因子测定目前常用的方法:免疫印迹(WesternBlotting)裂解液转移超声离心蛋白质量细胞因子抗体酶标二抗+酶底物发光暴光5、流式细胞技术6、Luminex技术7、高压液相技术8、质谱9、免疫组化10、层析技术四、细胞平台（一）流式细胞技术（二）细胞趋化（三）细胞黏附（分子）AdhesionMoleculesLigands（四）活细胞内蛋白质测定OHserineRasRafMAPKKp38MAPKPiP-p38MAPK（五）细胞凋亡五、细胞内信号转导通路临床检验科综合实验室临床检验科细胞培养室流式细胞仪的结果分析TreatmentgeometricmeanPvalueControl35.84±6.53LPS58.20+6.770.015*TNF-217.88+34.270.004**PAF36.98+5.060.823IL-1837.70+8.240.775EOT37.58+7.310.774pvalue:Comparewithcontrol四、流式细胞仪的实验室应用（一）科研工作1.细胞内信号转导2.细胞表面粘附分子3.细胞因子测定4.细胞分选（二）常规工作1.细胞分化抗原（CD）测定淋巴细胞亚群及活化淋巴细胞分析白血病及林巴瘤的免疫分型造血干细胞定量免疫功能监测PNH检测血小板功能检测2.DNA倍体分析3.细胞凋亡相关蛋白分析1.细胞因子测定细胞因子（Cytokine,CK）是机体炎症和免疫应答过程中一类由免疫细胞(淋巴细胞、单核巨噬细胞等)和相关细胞(成纤维细胞、表皮细胞、内皮细胞等)产生的具有调节细胞功能的小分子多肽类物质。细胞因子测定细胞外细胞因子测定ⅰ以前常用的方法:放免法ⅱ现在常用的方法:酶免法(ELISA)+细胞因子+酶标抗体复合体抗细胞因子抗体双夹心+酶底物比色测定+细胞因子捕获微珠+荧光抗体复合体细胞外细胞因子测定IL-1IL-8IL-10BeadsProvideaFlexiblePlatformMultiplesizesBeadsprovideanexpandableassayplatformforusewithaflowcytometerDifferentintensitiesDifferentcolorswithdifferentintensities细胞外细胞因子测定IL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12CaptureBeadsLysateorSupernatantSampleDetectorAntibodiesWashAnalyzeonflowcytometerCytometricBeadArray(CBA)散点图CBA标准曲线细胞内细胞因子测定目前常用的方法:免疫印迹(WesternBlotting)裂解液转移超声离心蛋白质量细胞因子抗体酶标二抗+酶底物发光暴光细胞内细胞因子测定裂解液荧光抗体2.细胞内信号转导通路相关蛋白测定科研工作细胞内信号转导的概念：细胞内信号转导主要是指细胞通迅过程中细胞因子、激素等因子作用于细胞表面(或胞内)受体后,信号发生跨膜传递,形成胞内第二信使以及其后的信息分子级联传递、诱导基因表达和引起生理反应的过程。2.细胞内信号转导通路相关蛋白测定科研工作OHserineRasRafMAPKKp38MAPKPiP-p38MAPK抗P-p38MAPK抗体WesternBlotting2.细胞内信号转导通路相关蛋白测定3.细胞凋亡测定细胞凋亡（CellApoptosis）的定义：是借用古希腊语，表示细胞象秋天的树叶一样凋落的死亡方式。细胞凋亡测定(1)细胞形态（2）对染料吸收能力（3）相关蛋白质、酶及活性（4）线粒体功能（5）DNA结构及含量（6）凋亡小体（7）膜脂分布正常细胞细胞存在方式凋亡细胞坏死细胞PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测:PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生,可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。活细胞为（AnnexinV-/PI-）坏死细胞为（AnnexinV+/PI+）凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）正常细胞凋亡细胞坏死细胞细胞凋亡测定流式细胞区分正常细胞、凋亡细胞与死亡细胞AdhesionMoleculesLigands4.细胞表面粘附分子测定细胞表面粘附分子测定ChemoattractantsTNF-α,IL-1,IL-4Selectin,ICAM-1IL-8TNF-α,IL-1TNF-α,IL-1,IL-4,IL-5,GM-CSFIL-8,Eotaxin,MCP,MIP,PAFIL-3,IL-5,GM-CSFIL-5Bloodstream细胞表面粘附分子测定直接荧光法间接荧光法5.细胞分选1.细胞表面分化抗原测定（Clusterofdifferentiation，CD）定义：细胞正常分化成熟过程中不同阶段以及某类细胞向不同功能类型细胞分化后细胞表面出现或消失的标志性抗原物质。精细胞卵细胞胚胎细胞（全能干细胞）（多能干细胞）（多能干细胞）（定向干细胞）淋巴样细胞髓样干细胞祖T细胞祖NK细胞祖B细胞T细胞NK细胞B淋巴细胞红系粒-单系嗜酸粒系嗜碱粒系巨核系红细胞嗜中性粒细胞单核细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞巨核细胞血小板浆细胞抗体调节性T细胞效应性T细胞Th细胞Ts细胞Tc细胞Tdth细胞TH1细胞TH2细胞造血干细胞骨髓基质细胞细胞表面分化抗原淋巴样细胞祖T细胞祖NK细胞祖B细胞T细胞NK细胞B淋巴细胞辅助性T细胞（Th）Th2细胞Th1细胞CD34+CD3+CD3-/CD19+抑制性T细胞（Ts）细胞毒性T细胞（Tc）造血干细胞CD3+CD4+CD34+CD3-/CD8+CD16＋CD56+CD3+CD8+/CD19-CD3+CD8+CD28+/CD19-细胞分化抗原外周血白细胞分离策略Percoll1.082/mlBuffyCoatErythrocytesCentrifugeLymphocytesNeutrophilsEosinophi