谷氨酸发酵培养基

谷氨酸发酵培养基制备发酵原理1.合成途径谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。2.发酵过程在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如下：①氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。②温度。菌种生长的最适温度为30～32℃。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到34～37℃。③pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.0～8.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。④磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。发酵结束后，常用离子交换树脂法等进行提取。操作步骤1．一级种子培养工与制：按下列培养基配方配制1000ml一级种子培养基。按20%装液量分装后，于121℃灭菌30min冷却备用。葡萄糖2.5%尿素0.5%硫酸镁0.04%磷酸氢二钾0.1%玉米浆2.5~3.5%硫酸亚铁、硫酸锰各20ppm、pH7.02．一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的种子培养基中（250ml三角瓶内接入1~2环）于32℃±1℃、250r.p.m条件下培养12h。一级种子质量要求：种龄12hpH6.4±0.1光密度：净增O.D值0.5以上无菌检查阴性，噬菌体检查无。3．二级种子培养基配制：按下列培养基配方配制1000ml二级种子培养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121℃灭菌30min冷却备用。水解糖2.5%玉米浆2.5~3.5%K2HPO40.15%MgSO40.04尿素0.4%FeSO42ppmMnSO42ppmpH6.8~7.04．二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.5~1.0%接入上述已培养好的一级种子，于32℃±1℃、250r.p.m条件下培养7~8h，二级种子质量要求：种龄7~8hpH6.8~7.2OD值净增0.5左右无菌检查（一）、噬菌体无、残糖消耗1%左右镜检生长旺盛，排列整齐，G+5．发酵培养基配制按下列培养基配方制发酵培养基，并按20%装液量分装于250ml三角瓶中，水解糖10%，甘蔗糖蜜0.18~0.22%，玉米浆0.1~0.15%，Na2HPO40.17%，KCl0.12%、MgSO40.04%，用NaOH（5%）溶液调pH7.20于110℃灭菌20min冷却备用。6．发酵：按8~10%的接种量在发酵培养基中接入合格的二级种子注，于35℃±1℃、250r.p.m条件下发酵35h，发酵过程中①从第4h后开始用无菌注射器补入尿素，尿素流加按pH值进行控制即8h前pH7.0~7.6；8h后pH7.2~7.3，20~24hpH7.0~7.1，24~35h，pH6.5~6.6。尿素流加总量为4%。②从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的水解糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。7．镜检及谷氨酸测定：在8h及24h时分别各取样一次进行镜检，经单染后观察菌体形态，发酵结束后，用华勃氏呼吸器测定发酵液中谷氨酸含量。说明：ppm是英文partspermillion的缩写，译意是每百万分中的一部分，即表示百万分之（几），或称百万分率。如1ppm即一百万千克的溶液中含有1千克溶质。ppm与百分率（％）所表示的内容一样，只是它的比例数比百分率大而已。在花卉生产栽培中，常常施用“微肥”和“植物激素”，这些药剂在施用时，其用量甚微，每千升的容量中只含有几毫克甚至更少，故用“ppm”来表示。也就是说，在配制1ppm浓度时，1克农药或肥料(指纯量)加水1吨(1000000克)，目前，在大多数科技期刊中，已经不使用ppm，而改用“‰”，ppm换算成‰为：1ppm=0.001‰。简单的说：1ppm=1mg/kg=1mg/L=1×10-6常用来表示气体浓度，或者溶液浓度。