神经生物学常用研究方法

神经生物学常用研究方法王海萍([e-mail])安徽医科大学神经生物学教研室神经科学的兴起中国内经（汉或秦）：脑为诸髓之海国外：医学之父希波克拉底（Hippocrates，460—377BC.）提出脑是精神活动的器官;而古罗马医学家盖伦则认为,脑是理性灵魂的器官,感觉、记忆、思维、想象、判断等都是脑的功能；德国医生加尔指出脑是思想的器官“颅相学”盖伦（129-200）：医学上的权威仅次于希波克拉底，他认为人体具有三种灵魂，即（一）生长灵魂，这是人、动物和植物所共有的，在人体它位于脐部；(二）动物灵魂，这是人和动物所共有的，它位于心脏、主管感觉和运动；(三）理性灵性灵魂，这只有人才具备,位于脑部，主管智慧。希波克拉底（公元前460-377）：被西方尊为“医学之父”的古希腊著名医生，欧洲医学奠基人，古希腊医师，西方医学奠基人。提出“体液(humours)学说”，认为人的体液由血液、粘液、黄胆和黑胆组成；破除巫术和宗教对医学的禁锢，医病人，而不是病；提出大脑是神经系统的中心，批评亚里斯多德关于心脏是思维器官的说法加尔（19世纪初）：德国的解剖学家，专门从事颅骨和脑的研究。颅相学指分析人的心理与头颅形状之间关系的理论学说。加尔从小就喜欢观察人的外表（尤其是颅骨外表）同心理的关系。例如，他根据个人长期的个案观察，发现眼睛明亮的人，一般记忆力较好；头骨隆起的人，可能象征着贪婪的脑机能，是监狱中扒手的特征等。根据当时生理和解剖知识，写了一套名为《神经系统的解剖学和生理学》的系列著作，除了就神经系统及其机能进行严谨、保守的阐述之外，还兼论颅相学。神经科学(1990-2000脑的十年)(2001-2100脑的世纪)生命科学解剖学生理学生物化学…………………认知科学（人类感知和思维信息处理过程的科学）开发脑开发人脑增强智能模拟人脑智能电脑保护脑寿命延长PD,AD,中风高速交通颅脑,脊髓外伤生活节奏焦虑,抑郁,精神病生活质量镇痛祛痛社会开放吸毒问题了解脑分子细胞网络全脑(离体研究)(无创在体研究)Patch（电）脑地形图RIA(化学）PET(化学）PCR(基因）fMRI(功能）ConfocalCT(形态）(形态）行为变化百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(I)C.S.Sherrington(英)18571850190019502000C.Golgi(意)19261934神经元染色方法18431852R.Cajal(西班牙)“神经元学说”形态190619521932•“突触”定名•“反射”概念•“交互”抑制反射学说生理电生理18891977•感觉神经纤维电活动•传入冲动大脑诱发电位•神经控制骨骼肌运动机制E.D.Adrian(英)电生理O.Loewi(德英)196118731936（乙酰胆碱）神经化学•蛙心灌流实验•“迷走物质”19681875H.Dale(英)•神经末梢分泌•乙酰胆碱ACh神经化学18741965194419631888J.Erlanger(美)H.S.Gasser(美)•阴极射线示波器•神经纤维的分类ABC19731881W.R.Hess(瑞士)•脑立体定位仪hypothalamus方法学创新1949电生理OxfCambridge徒手切脑片银染神经元染出神经末梢，发现神经元之间无原生质联系巴浦洛夫（1904）百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(II)神经药理学分子药理学1850190019502000J.C.Eccles(澳大利亚)191419031963A.L.Hodgkin(英)B.Katz(德英)1917A.F.Huxley(英)•细胞内微电极•突触后电位•抑制性递质突触•电压钳技术•动作电位的离子学说•数学方程表述•NM终板电位•递质“量子释放”1911动作电位机制19051983U.VonEuler(瑞典…)•交感神经递质•去甲肾上腺素1970•儿茶酚胺代谢•影响CAs的药物电生理1912J.Axelrod(美)（儿茶酚胺）神经化学1913(左右脑)R.W.Sperry(美)1981“脑功能侧化”D.Hubel(加美)19261924T.Wiesel(瑞典美)信息加工视皮层E.Neher(德)1991B.Sakmann(德)•大脑视觉信息加工•视觉系统发育的可塑性膜片钳单通道方法学•膜片钳技术•单个离子通道电流记录1999英，澳CambridgeCambridgeLeviMontalcini1986NervegrowthFactor(NGF)(Italy)百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(3)1850190019502000192619232000P.Greengard(美)1930E.Kandel(美)A.Carlsson(瑞典)神经系统中的信号转导蛋白磷酸化慢突触传递多巴胺生理科学进展2001年第32卷第2期2004年诺贝尔生理学或医学奖颁发给美国科学家理查德·阿克塞尔和琳达·巴克，以表彰他们在人体气味受体和嗅觉系统组织方式研究中作出的杰出贡献。神经科学的特点多学科综合神经科学神经解剖学神经生理学神经生物化学心理学………..神经科学的特点多层次的研究认知神经科学计算神经科学临床神经科学系统和行为神经科学发生神经科学细胞神经科学分子神经科学神经科学研究水平整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听觉，痛觉等细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测分子水平的实验：离子通道、受体、酶、遗传物质等神经生物学常用研究方法形态学方法大体：解剖、影像组织：常规染色和特殊染色、束路追踪、免疫组化、原位杂交、神经细胞培养等生理学方法生物化学方法分子生物学方法神经影像（Neuroimaging）•Invasive:•Singleunitrecording•Multi-unitrecording•PET(positronemissiontomography)•Non-invasive:•CT(computedtomography)•ERP(event-relatedpotential)•MEG(magnoencephalography)•MRI(magneticresonanceimaging)•fMRI(functionalmagneticresonanceimaging)ChoiceoftheMethodsChoiceofthemethodsdependsonthescientificquestionbeingasked.Forneuronalactivity,atacellularlevel,usesingle-ormulti-unitrecording.Forquestionsofstructure,useCTorMRI.Forquestionsoffunction,orsysteminteractions,wheretheanatomyisofinterest,usePETorfMRI.Forquestionsofprocessing,wheretimingisimportant,useERPand/orMEG.Single-&Multi-unitRecordingInvasive:implantinganelectrodeintothebrainPassive:recordingtheactivity(actionpotentials)ofoneormoreneurons,notstimulatingactivityUsuallyonlydonewithanimalsorpeoplerequiringneurosurgeryPositronEmissionTomography(PET，正电子发射计算机断层显像)O15WaterFDGorF18fluorodeoxyglucose18F-FDGPET脑代谢显像，正常人与老年性痴呆对照，患者双侧顶叶、颞叶皮质对称性低代谢。18F-DOPAPET脑受体显像，正常人与帕金森氏病脑纹状体多巴胺受体密度影像对照，患者双侧纹状体密度明显减少CTorCATscan(ComputedTomography)Magnetoencephalography(脑磁波描计术，MEG)151ChannelMEG•Currentflowinneuronscreateslocalmagneticfields•MEGmeasureslocalmagneticfieldchangesfromthesurfaceofthescalpusingsuperconductingcoilsorSQUIDs•Excellenttemporalresolution•BetterspatialresolutionthanERPMRIvsMEGMagneticResonanceImaging(MRI)fMRI(functionalmagneticresonanceimaging)BrainactivityOxygenconsumptionCerebralbloodflowOxyhemoglobinDeoxyhemoglobinMagneticsusceptibilityT2*MRIsignalintesity组织学与细胞学常规染色和特殊染色束路追踪免疫组化原位杂交神经细胞培养等常用普通染色方法TTC染色HE锇酸染色氯化金浸染Cajal银浸染色尼氏染色HE（苏木素－伊红）锇酸染色是神经科学研究的一种常用而普遍的方法，它本来是用来固定脂质的，由于髓鞘的主要成分是脂质，所以用于有髓神经纤维的染色锇酸染色氯化金浸染运动终板Ach荧光染色氯化金浸染Cajal银浸染色尼氏染色多种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染料均可以使尼氏体着色束路追踪原理：轴浆运输示踪物质：HRP，荧光染料，各种标记物标记的葡萄糖，放射性核素标记的氨基酸等。观察：根据示踪物质不同，采用组织显色、荧光显微镜或放射自显影等方法。免疫组化原理示意图：间接法：直接法：免疫组化根据二抗标记的不同（荧光素、酶、铁蛋白、胶体金或银标记），免疫组化包括免疫荧光、免疫酶组织化学、免疫金银及铁标记技术原位杂交核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。原位杂交此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：①利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA)；②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA)；③依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。原位杂交组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。生理学方法最常用的有两种神经行为学电生理学一、神经行为学Behavioralneuroscienceisthestudyoftheneuralmechanismsmediatingnormalandabnormalbehaviors.自主活动动物焦虑检测：实施焦虑因素，如饮食或饮水剥夺，检测反应，可以用于药物筛选。性和生殖行为：进化，神经内分泌作用机制学习记忆摄食行为惊恐反射社会行为……..自主活动箱实