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核酸的定性分析【目的】1．掌握测定核酸的组成从而定性分析DNA或RNA的方法。2．熟悉测定核酸的组成从而定性分析DNA或RNA的原理。【原理】RNA和DNA均可被硫酸水解生成含氮碱（嘌呤碱与嘧啶碱）、戊糖（RNA中的核糖与DNA中的脱氧核糖）和磷酸。水解产物可用下列方法鉴定。1．嘌呤碱的鉴定原理嘌呤碱在弱碱性环境中能与硝酸银作用形成嘌呤银化合物。初为乳白色，稍放久为浅灰褐色絮状物。2．核糖的鉴定原理核糖经浓盐酸或浓硫酸作用，脱水生成糠醛，后者能与3，5-二羟甲苯缩合形成鲜绿色化合物。该反应需三氯化铁作为催化剂。3．脱氧核糖的鉴定原理脱氧核糖在浓酸中脱水生成ω-羟基γ-酮基戊醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。4．磷酸的鉴定原理定磷试剂中的钼酸铵在酸性环境中以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸。后者在还原剂氨基萘酚磺酸作用下形成蓝色的钼蓝。【器材】1．试管与滴管2．PH试纸3．沸水浴4．带有长玻璃管的胶塞【试剂】1．5%硫酸2．5%硝酸银溶液3．浓氨水4．3,5-二羟甲苯试剂取FeCl3·6H2O1.0g溶于6ml水中，加浓盐酸100ml，混匀，此为A液。另配制6%3,5-二羟甲苯乙醇溶液为B液。临用时用A液100ml加B液3.5ml混合即可。5．二苯胺试剂取二苯胺1.0g溶于100ml冰乙酸中，加浓硫酸2.75ml。此二苯胺试剂遇光易变绿色，故临用前配制，贮于棕色瓶中，置冰箱保存。6．钼酸试剂取钼酸铵2.5g溶于20ml水中，加浓硫酸（A·R）8.5ml,冷却后再加水至100ml，放冷处可保存4周左右。7．氨基萘酚磺酸溶液取15%亚硫酸氢钠溶液195ml与20%亚硫酸钠溶液5ml混合，加氨基萘酚磺酸0.5g，在热水浴中搅拌使固体溶解（如不全溶，可滴加20%亚硫酸钠数滴，至多不超过1ml即可）。此溶液置冷处可保存2-3周，如颜色变黄需重新配置，临用前将上述溶液以蒸馏水稀释10倍应用。8．核酸样品称取粗制核酸样品10mg/每组。或者，取本教材实验九从动物组织中提取出的核酸作为本次实验的样品。【操作】1．核酸的水解向加入10mg核酸样品的试管（或者，向有核酸沉淀的离心管）中加入5%硫酸4ml，用玻璃棒搅匀，再用带长玻璃管的塞子塞紧管口，于沸水浴中加热15min，既得核酸的水解液。2．核酸的鉴定（1）嘌呤碱的鉴定：取小试管2支，分别标明测定与对照，按下表依次加入试剂，混匀，放置15min，观察嘌呤银沉淀的生成，并记录颜色。试管水解液5%H2SO4浓氨水5%硝酸银颜色测定管20滴—数滴，呈碱性10滴对照管—20滴数滴，呈碱性10滴注：加氨水（约2～3滴）以中和酸，呈碱性即可，需用PH试纸测试。若加氨水过多，则生成银氨络离子[Ag(NH3)4]+，使银离子减少，嘌呤银沉淀减少。（2）核糖的鉴定：取试管2支，分别标明测定与对照，按下表操作：试管水解液5%H2SO43,5-二羟甲苯试剂颜色测定管4滴—6滴对照管—4滴6滴将两管同时放入沸水浴加热15min，观察颜色变化并记录。（煮3～5min，即可先观察）（3）脱氧核糖的鉴定：取试管2支。分别标明测定与对照。按下表操作:试管水解液5%H2SO4二苯胺试剂颜色测定管20滴—30滴对照管—20滴30滴将两管同时放入沸水浴中加热10min，观察颜色变化并记录。（4）磷酸的鉴定：取试管2支，分别标明测定与对照，按下表操作：试管水解液5%H2SO4钼酸氨基萘酚磺酸颜色测定管10滴—40滴20滴对照管—10滴40滴20滴于室温放置10min后，观察颜色变化并记录。【注意事项】1．为了安全，核酸水解时，避免将长玻璃管的管口对准人。2．嘌呤碱的鉴定中氨水不能加的过多。【思考题】1．DNA和RNA在组成上有什么区别？如何鉴别？2．为什么嘌呤碱的鉴定中氨水不能加的过多？