生化与分子生物学研究思路与技术-陈汉春课件

1生化与分子生物学研究思路与技术中南大学生物科学与技术学院生物化学系,生物化学研究所陈汉春0731-82650411E-mail:[e-mail]2生物化学:•研究活细胞及有机体内各种分子及其相互间化学反应的科学。•研究活细胞的化学组成及相互反应和进程的科学，即“生命的化学”。•生命科学的基础语言，即研究生命的分子基础(molecularbasisoflife)。3一.生物化学研究的目的：•从分子水平了解活细胞相关的所有化学进程。•对健康、营养的理解和维持以及对疾病的发生机理的阐明和有效治疗。4二.生物化学的研究对象：•研究生物分子的组成成分如碳、氢、氧、氮、磷等化学元素以及水和无机盐代谢。•研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、多糖及脂类的结构、功能、结构与功能的关系以及这些生物大分子的代谢和相互作用。5三.生物化学研究的发展：生物化学研究历经两百多年进入分子生物学年代，走过了三个发展阶段：叙述生物化学阶段动态生物化学阶段功能或分子生物化学阶段61.叙述生物化学(descriptivebiochemistry)阶段(1770～1903)又称为静态或形态生物化学(staticormorphologicalbiochemistry)。研究生物体内主要化学物质的组成；分离出各种氨基酸、脂酸、甘油、糖类、柠檬酸、乳酸和苹果酸；从肝中分离出糖元；发现了核质（nuclein）及核酸；奠定了酶学基础理论。7我国人民在公元前二十一世纪，已用曲酿酒，称曲为酒母，又叫做酶；公元前十二世纪，已将豆、谷发酵，捣烂、加盐以造酱，并制出麦芽糖，当时称为“饴”。公元九世纪或十世纪已制成豆浆和豆腐。此阶段中国人民的贡献：82.动态生物化学(dynamicbiochemistry)阶段（1903～1950）•又称为生理化学（physiologicalchemistry）。主要研究生物体内组成物质的化学变化。分离制备结晶酶；阐明细胞氧化和呼吸链及维生素和激素化学性质与生理作用；建立了有关发酵和三羧酸循环、脂酸的β－氧化作用以及肝中尿素合成的完整生化途径等。9此阶段中国人民的贡献：•我国生物化学家建立了血滤液制备与血糖测定的生化方法；提出了蛋白质变性学说；首先使用定量分析技术研究抗原抗体反应的机理。103.功能或分子生物化学（functionalormolecularbiochemistry）阶段（1950年至今）•从分子水平探索蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功能的相关和它们的相互作用，包括蛋白质和核酸的提纯及其化学组成、氨基酸或核苷酸的一级结构序列以及空间构型、构象的确定；建立DNA双螺旋模型；人工合成肽激素、tRNA和核酶；建立分子克隆技术和遗传工程技术等。11此阶段中国人民的贡献：•我国生化工作者于1965年首先成功合成了有生物活性的牛胰岛素；1972年借助X-射线衍射技术研究了猪胰岛素分子的晶体结构；1981年首次合成具生物活性的酵母丙氨酸tRNA；九十年代，成功制备重组Ⅷ因子和促红细胞生成素(EPO)；参与完成人类基因组计划。12四.生化研究的基本思路和技术路线：•经典的生物化学研究包括三个主要步骤：分离细胞器和生物分子。判断生物分子的结构。分析生物分子的功能和代谢（合成与分解）及其相互作用。131.细胞器和生物分子的分离：•细胞器是一种独立亚细胞单位。一般采用匀浆及离心等进行亚细胞分离。分离后还必须采用测量“标志”酶及特殊化学成分或电子显微镜观察的方法来评估各亚细胞组分。14•要了解生物分子的结构，首先必须得到纯化的生物分子。用于分离和纯化生物分子的方法很多，例如盐析法、层析法、凝胶过滤、电泳、超速离心等。要得到均一性的生物分子往往需要综合性采用多种方法。15亚细胞器/单位标志物主要功能细胞核线粒体核糖体内质网溶酶体胞膜高尔基复合体过氧化物酶体细胞骨架细胞质DNA谷氨酸脱氢酶高丰度的RNA葡萄糖-6-磷酸酶酸性磷酸酶Na+-K+-ATP酶,5′-核苷酸酶半乳糖基转移酶过氧化氢酶,尿酸氧化酶没有特征性酶乳酸脱氢酶组成染色体，携带遗传信息。以自身为模板指导合成RNA（转录）。三羧酸循环，氧化磷酸化。蛋白质合成位点（以mRNA为模板翻译成蛋白质）。合成多种脂类，氧化外源性生物分子（细胞色素P450）。含有众多水解酶（酶促降解反应）。转运物质进出细胞，细胞粘附和联系。细胞内的蛋白质分类，糖基化作用，硫化反应。降解部分脂肪酸和氨基酸，产生和分解过氧化氢。微丝、微管、中间纤丝。糖酵解酶类，脂肪酸合成酶。细胞器的标志性成分和主要功能162.生物分子的结构确定：•质谱和核磁共振。•某些已知特性的酶。•X-射线衍射和晶体学方法。173.生物分子的功能和代谢分析：1）生物分子的功能分析人类和动物的研究最初是从动物整体水平开始的，例如对呼吸和消化的研究。将许多整体动物水平的复杂现象转移到体外研究则简单得多。18策略方法动物整体水平研究去除一个器官(例如切除肝脏)。改变能量来源(例如禁食)。给予药物(例如苯巴比妥)。给予有毒药物(例如四氯化碳)。利用有特定疾病的动物(例如糖尿病)。离体器官灌注肝脏、心脏、肾脏灌注。灌注可以维持离体器官的功能达数小时，可以不受其它器官和神经系统的影响而独立研究某个器官。组织切片细胞研究组织匀浆如肝脏切片。器官切片不受该器官其它部分的影响,但由于缺氧，在几小时内切片组织的状态会变差。如血细胞,因为血细胞相对容易纯化。细胞可在体外较长时间培养。可以加入或去除某些特殊成分而研究它们的作用。通过离心分离亚细胞器。分离细胞器分离亚细胞组分抽提、离心制备，细胞器结构和功能研究。超离心制备，细胞器功能研究。代谢物和酶的分离及特征确定化学组成、组织表达谱、酶学特性及化学反应途径分析。酶或蛋白质的基因克隆生物信息学分析蛋白质功能分析基因克隆及其编码的酶或蛋白质的氨基酸序列分析，基因定位及表达调控分析。序列比较、空间结构及功能域预测。基因敲除或转基因动物，核酸-蛋白质及蛋白质-蛋白质相互作用分析。不同层次研究生物分子功能的方法192）生物分子的代谢分析：•生化代谢途径是指一系列由酶催化的生物化学反应，这些反应包括由一个或多个简单的分子合成复杂的复合物以及一个复合物降解为其终产物的过程。20•某些氨基酸、糖和脂肪酸可以与一个合适的稳定同位素结合，然后注入动物体内或用于体外实验来观测它们的代谢过程。这些研究证实代谢是一个很活跃的过程，细胞内大部分复合物都在不停地合成和降解。21五.分析生化反应的总体策略：•整体动物水平观察和推论某种生化反应或代谢途径的存在→将它定位于一个或多个器官→定位于一个或多个细胞器或亚细胞组分→纯化该反应的底物、产物、酶和辅因子及其它成分→确定该反应的体外控制机制→分析该反应的体内调控机制→体内外重建该反应。22六.生化研究技术的进步：•生命科学研究的主要目的在于获得最新的基础信息，例如纯化和鉴定新发现的酶及其功能，生物化学与分子生物学新技术、新方法不断涌现，为生命科学研究工作者提供了有用的工具。231.细胞器及生物分子的分离与纯化：•研究细胞器及生物分子的结构与功能及其代谢和作用机制，必须从组织或细胞中分离出这些生物分子或亚细胞复合物。24基本技术：匀浆离心层析电泳251）匀浆:破坏细胞或组织的固有结构，使细胞破裂而释放胞内容物。方法:化学(酶消化)、物理(超声)或机械(碾磨)。要求:保持生物分子或亚细胞结构的完整性。措施:合适pH值、合适离子强度、缓冲液、低温(0℃～4℃)、短时间、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂。26使样品绕离心机转轴的中心旋转而获得一个远大于地球重力的沉降应用力，样品介质中不同大小、形状和密度的颗粒将以不同的速度沉降。影响因素:离心力(转速及颗粒与中心轴的距离)，颗粒的大小、形状、密度，介质的粘度。2）离心：27低速离心:≤6000r/min、室温，RCF(相对离心力)≤6000g。高速离心:6000～25000r/min、低温，RCF=6000～60000g。超速离心:25000r/min、低温+真空，RCF=60000～600000g。差速离心:连续用几种递增的离心速率离心。密度梯度离心:样品中不同组份在离心力场的作用下停留于相应密度的支持物层面。类型:28根据样品中各组分物理生化特性、分子大小形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性或亲和性等的不同而将它们分离。类型:吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤、疏水相互作用层析、亲和层析、共价层析和金属螯合层析。3）层析（色谱分析）：29常用层析法:薄层层析和纸层析；柱层析；高效液相层析；气相色谱。30①薄层层析和纸层析:将样品点在薄层或纸(支持基质又称层析床或固定相)的一端，展层剂(流动相)沿着薄层或纸向上展开并带动样品中的物质迁移。相对迁移率:Rf=组分移动距离/溶剂移动距离；Rx=待测物移动距离/标准物移动距离。31②柱层析:将样品从装有固定相的柱顶部加入，然后在重力或蠕动泵的作用下使流动相过柱并带动样品中的不同组分进入固定相，样品中各组分在固定相中会形成不连续带型，继而用流动相洗脱，分别收集各时间段流出的洗脱液进行定量或定性分析。32334）电泳：根据带电荷的物质在电场中移动的原理而分离、分析复杂混合物及纯化、鉴定离体生物分子。影响因素:分子所带的净电荷量、分子的形状与大小及电场强度。34电泳支持物:惰性支持物(如醋酸纤维素):仅提供物理支持，分离效果取决于电荷密度。多孔支持物(如Agarose、PAG):同时利用了分子筛效应，分离效果取决于电荷密度和分子大小及形状。35电泳缓冲系统:连续缓冲系统:样品、凝胶和缓冲液含有相同的缓冲离子，具有相同的pH值。非连续缓冲系统:凝胶及缓冲液中的缓冲离子和pH值均不同。36常用电泳技术:基本电泳等电聚焦毛细管电泳双向电泳37①基本电泳:纸电泳、醋纤膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。3839②等电聚焦:在pH梯度下进行。pH梯度由结构类似的小分子量两性电解质形成，等电点(pI)在pH3～10之间。当存在外加电场时，每一种两性电解质向其pI值处移动而形成稳定的pH梯度。电泳过程中每一种带电分子都朝自己的pI位置移动而被分离。40③毛细管电泳:毛细管电泳的特点在于分辨力高和应用范围广，可以分析极少量的样品(5nl～10nl)。较常应用的有毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦。41④双向电泳双向电泳是一种分辨力极高的电泳技术，目前广泛用于基因表达谱及蛋白质组学分析，可一次性分离1000多种蛋白质。第一向:根据蛋白质所带的电荷而进行等电聚焦。第二向:利用样品分子的相对分子质量不同，在另一方向上进行SDS-PAGE。42432Dgelinproteomics44点匹配结果:实验组和对照组蛋白点匹配图452.生物分子的分离与纯化：1）蛋白质纯化；2）DNA提取；3）RNA提取；4）糖类提取；5）脂类提取。461）蛋白质纯化:目的:确定蛋白质的结构、功能及结构与功能的关系；研究酶的动力学及其调节；药用成份的分离与鉴定。方法:匀浆、离心、电泳、过滤、层析、抽提、透析等。要求:合适的缓冲体系、低温、蛋白酶抑制剂。浓度和质量检测:分光光度法、PAGE。472）DNA提取:原则:保持核酸一级结构的完整性。去除杂质，保证核酸足够纯。步骤：①破膜释放出目的核酸。②分离通过酶、有机溶剂、调节pH值、离心等手段得到粗制品。③纯化进一步去除杂质。浓度和质量检测:分光光度法、Agarose凝胶电泳。48基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱M:λDNA/HindIII分子量标准，泳道1～4分别代表4个不同样品的基因组DNA493）RNA提取:哺乳动物细胞总RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核内小分子RNA(10%-15%)、mRNA(1%-5%)组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。注意事项:使用RNA酶抑制剂；防止污染。50总RNA和mRNA的琼脂糖凝胶（1％）电泳图谱51七.生物分子的结构与功能分析：1.蛋白质结构分析2.酶活力检测3.蛋白质组学分