Agilent色谱柱选择与保养

AgilentTechnologies1页HPLC色谱柱选择与维护保养Sa安捷伦科技AgilentTechnologies2页安捷伦HPLC色谱柱选择AgilentTechnologies3页分离模式的选择样品溶于有机溶剂溶于水溶于四氢呋喃非离子化离子化溶于有机溶剂溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用硅胶的正相模式用键合相的正相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相模式用硅胶的正相模式离子交换模式凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式分子量2,000分子量2,000AgilentTechnologies4页反相分配色谱极性:固定相流动相固定相-非极性流动相(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-极性非极性物质后出峰正相吸附色谱极性:固定相流动相固定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰正相&反相色谱AgilentTechnologies5页•硅胶基质-pH3~8•Al2O3.nH2O-pH1~14•聚合物基质-pH1~14高或低pH下,硅胶会溶解化学修饰困难孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损柱填料基质AgilentTechnologies6页C-18柱---性能影响因素•键合类型•碳覆盖率•封端化学性质物理性质•硅胶纯度•色谱柱尺寸•颗粒形状•粒径•表面积•孔径AgilentTechnologies7页硅胶纯度•填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸•填料床的长度和内径颗粒形状•球型或不规则型粒径•平均颗粒直径,通常3-10µm表面积•颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/gram表示孔径•颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å色谱柱物理性质C-18柱---性能影响因素AgilentTechnologies8页键合类型•单体键合-键合相分子与基体单点相连•聚合体键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率•与基体物质相连的键合相的量封端•键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来色谱柱化学性质C-18柱---性能影响因素AgilentTechnologies9页二氧化硅NaKMgAlCaTiFeZrCuCrZnZorbaxRx-SIL10341.52nd3ndndnd1ZorbaxSIL17ndnd5793221881nd88Nucleosil56N/AN/And1305776ndN/AN/AndHypersil2900N/A403003865230N/AN/AN/AN/And=未检出金属浓度（ppm)A类硅胶OriginalZORBAXSIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不发生拖尾ZorbaxRx-SIL:11种金属35ppm(未检出其他杂质,1ppm);99.995%纯度的二氧化硅C-18柱---性能影响因素AgilentTechnologies10页ZORBAX®生产工艺硅胶+脲(pH=2)+甲醛CH2O孔径80A&300ADO2250oC粒径1.8µm3.5µm5.0µm7.0µm安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术•StableBond•EclipseXDB•Bonus-RP•ExtendZORBAXRx多孔硅胶微球AgilentTechnologies11页色谱柱尺寸---对色谱分离的影响•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长•窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高•宽径柱(3-21.2mm)-载样量高C-18柱---性能影响因素AgilentTechnologies12页颗粒形状---对色谱分离的影响当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时,球型颗粒可以降低柱压,延长色谱柱寿命C-18柱---性能影响因素球形不规则形粒径---对色谱分离的影响较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5µm的粒径1.8µm3.5µm5µm7µm10µmAgilentTechnologies13页表面积---对色谱分离的影响高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力,柱容量和分离度.表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要C-18柱---性能影响因素孔径---对色谱分离的影响大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品MW4,000,选择80Å的孔径样品MW4,000,选择300Å的孔径AgilentTechnologies14页大孔径填料适用于大分子分析*大孔径300Å全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽分子量虽小但hydrodynamicvolume(水动力学体积)较大的分子*Poroshell色谱柱高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配AgilentTechnologies15页300Å孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18(300Å)SB-C18(80Å)PW1/2孔径,分子量对峰宽的影响(梯度分离)选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形AgilentTechnologies16页300Å孔径可改善大分子的峰形色谱柱:4.6x150mm,5mm流动相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸流速:0.75mL/min温度:RT检测器:UV282nm•溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径•窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3(80Å)300SB-C3(300Å)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰乐菌素)MW.926分子量虽小但hydrodynamicvolume(水动力学体积)较大的分子AgilentTechnologies17页键合类型---对色谱分离的影响单齿键合：提高传质速率,加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量C-18柱---性能影响因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOOAgilentTechnologies18页碳覆盖率---对色谱分离的影响高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间封端---对色谱分离的影响封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异C-18柱---性能影响因素AgilentTechnologies19页固定相键合二甲基硅烷封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术AgilentTechnologies20页取代基：五个旁侧基团:异丙基ZorbaxStableBond空间位阻保护---抗水解能力键合相流失,保留减弱另一个裸露的硅羟基,潜在的拖尾因素普通硅胶柱低pH2不稳定,发生水解安捷伦专利的空间位阻保护AgilentTechnologies21页液相柱---保留值与pH的关系pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um部件号：880975-906流动相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6温度：500C流速：1.0mL/min.AgilentTechnologies22页12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75mm,3.5µm流动相:44%25mM磷酸,pH7.00:56%甲醇流速:1.0mL/min温度:25°C检测:UV250nm•可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化—甚至很小的0.05–0.25个pH变化单位.样品:1.ketoprofen2.ethylparaben3.Hydrocortisone4.fenoprofen5.propylparaben6.Propranolol7.ibuprofen液相柱---保留值与pH的关系0.25个pHAgilentTechnologies23页液相柱---保留值与pH的关系pH变化：0.2个pH(7.0~7.2)保留时间改变：1.2分钟(13.6~14.8分钟)保留时间随pH改变不明显保留时间随pH改变不明显(酸性环境中)AgilentTechnologies24页酸性组份中性组份碱性组份方法稳定区方法波动区(pKa+1.5)方法稳定区液相柱---保留值与pH的关系AgilentTechnologies25页液相柱---保留值与pH的关系StableBondC18pH1~8Bonus-RPpH2~9ExtendC18pH2~11.5EclipseXDBC18pH2~9AgilentTechnologies26页复杂组分的流动相pH选择技巧色谱柱:ZORBAXExtend-C184.6x150mm,5mm流动相:30%缓冲液:70%MeOHpH7缓冲液20mMNa2HPO4pH11缓冲液20mMTEA流速:1.0mL/min温度:RT检测器:UV254nm0512,345Time(min)76Extend-C18pH71.Maleate马来酸盐2.Scopolamine东莨菪碱pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黄碱pKa9.84.Doxylamine抗敏安(多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9.16.Triprol内径ine苯丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明pKa9.0Extend-C18pH1105101234Time(min)657高pH下,碱性成分的保留增加待测物pKa+1.5以外的流动相pH可保证方法的稳定性AgilentTechnologies27页Zorbax色谱柱发展史1973ZORBAXSIL发明专用于HPLC分离的球状、小颗粒硅胶(专利)1977ZORBAXODS单官能团,单层键合相发明者之一1978ZORBAXcolumn首先推出色谱柱的质量信誉保证1982ZORBAXGF-250改善了蛋白质尺寸分离的稳定性1987ZORBAXRx-SIL推出适合碱性化合物的HPLC分离的全新硅溶胶技术(专利)1990ZORBAXStableBond增强了低pH条件下键合相的稳定性(专利)1996ZORBAXEclipseXDB双封端技术提高了中等pH条件下键合相的稳定性(专利)1997ZorbaxLC/MScolumn15和30mm(3.5um)快速,高分辨率,高通量LC/MS色谱柱1998ZORBAXBonus-RP极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善(专利)1999ZORBAXCombiHT专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱1999ZORBAXEclipsedsDNA用于分析双链DNA的多孔硅胶柱1999ZORBAXCarbohydrate分析单,双,三糖和糖醇的专用柱1999ZorbaxExtendC18独特宽pH跨度,高pH下使用的硅胶基质色谱柱(专利)2001Zor