酶的化学修饰

退出传统的生物催化剂都是设计或优化催化过程去适应已有的生物催化剂。开始修饰或改造生物催化剂以适应特定的生物催化过程。希望能够实现先设计理想的催化过程，然后在寻找并改造得到理想的生物催化剂。理想生物催化剂：有良好的实际应用灵活性、稳定性和可生产性。退出一、酶分子修饰的原因1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2．作用的最适条件不符（温度、pH等）。3．酶的主要动力学性质的不适应。4．临床应用的特殊要求。消除抗原性、延长酶的半衰期、稳定性等第六章酶分子化学修饰退出二、酶修饰的方向1．核酸水平（生物酶工程的内容）通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。2．蛋白质水平（化学修饰、定点突变等）通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。退出酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。退出1、酶的结构基础辅因子催化基团全酶接触残基活性部位底物结合基团必需残基辅助残基酶蛋白结构残基非贡献残基三、酶结构基础退出①辅因子FAD、FMN：脱氢酶、氧化酶的辅酶NADH、NADPH：脱氢酶的辅酶磷酸吡哆醛：转氨酶的辅基Ca2+：－淀粉酶金属离子辅因子：②非贡献残基木瓜蛋白酶2/3，烯醇化酶1/5退出退出③结构残基结构残基在酶分子活性构象形成和稳定中起关键作用。溶菌酶分子中有4对S－C键，分别在6-127,30-115,46-48,76-94位连接。实验证明这4对二硫键中，6-127位之间的键断裂，酶不失活。这表明酶分子中的S－S键并非全部为维持活性构象所必需。退出退出④催化基团（部位）是在催化反应中直接参与电子接受关系的部位。牛胰凝乳蛋白酶Ser195，His57，ASP120枯草杆菌蛋白酶，Ser221,His64,ASP32退出⑤底物结合部位：酶活性部位直接与其底物结合的残基构成的空间部位。溶菌酶在水解细胞壁多糖的－1,4糖苷键时，酶活性部位凹穴，能容纳6个六碳糖单位，即有六个结合亚位点，来识别这些糖单位。⑥辅助残基黑曲霉产生淀粉酶糖肽链有助于酶附着生淀粉退出活性中心的重要化学基团7种氨基酸出现的频率最高LysAspGluCysHisTyrSer兰（赖）天果拌猪肉（酪）丝某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。赖氨酸的氨基天冬氨酸和谷氨酸的羧基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基酪氨酸和丝氨酸的羟基退出四、酶化学修饰的基本原理1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。退出3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。退出4、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。退出第一节酶分子化学修饰一、定义：修饰酶：通过各种方法使酶分子结构发生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能的过程。方法包括：物理的、化学的、生物学物理法：吸附固定化、包埋固定化高压修饰法、变温诱导改性酶退出二、主要作用：用于酶的结构和功能研究，探测酶的必需氨基酸残基的性质和数目，酶的构象变化和运动性，酶作用的化学机理。用于酶分子的固定化，提高酶的稳定性，酶活力提高酶的稳定性，酶活力，降低或消除酶的抗原性。定向改造酶分子性质，得到新特性和新功能的酶。退出三、酶分子化学修饰的形式（一）酶的表面修饰：化学固定化；酶的小分子化学修饰作用；酶的大分子化学修饰；分子内交联；分子间交联；脂质体包裹；反相胶团微囊化(二)酶分子的内部修饰：非催化活性基团的修饰；酶蛋白主链修饰；催化活性基团的修饰；肽链伸展后的修饰（三）与辅因子相关的修饰：辅因子的共价结合；引入新的具有强反应的辅因子；金属酶的金属取代。退出1.1化学固定化：通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上。（一）酶的表面修饰退出1.2酶的小分子化学修饰作用小分子化合物对酶活性部位或以外的侧链基团进行化学修饰，常用修饰剂有氨基葡萄糖、醋酸酐等。例：马肝醇脱氢酶的Lys乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力；其中甲基化使酶活力增加最大，同时酶的稳定性提高。退出1.3酶的大分子化学修饰大分子的非共价修饰：稳定酶多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等（如聚乙二醇、右旋糖苷）α-淀粉酶与其抗体的复合物在70℃半衰期为16小时，而天然酶为5分钟。大分子的共价修饰：如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素。用聚乙二醇修饰SOD,可以降低或消除酶的抗原性，提高抗蛋白酶的能力，延长酶的半衰期。退出1.4分子内交联含双功能团的化合物，如二氨基丁烷，戊二醛，己二胺等与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联。退出1.5分子间交联杂合酶用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联，可降低胰凝乳蛋白酶的自溶作用，也使反应器体积减小。退出1.6脂质体包裹脂质体是天然脂类和/或类固醇组成的微球体，酶分子包埋其内。它可以通过细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。退出1.7反相胶团微囊化退出2.1酶蛋白主链修饰酶分子主链和糖链的切断和连接①提高酶活力胰蛋白酶原→胰蛋白酶（蛋白酶除去1个6肽）凝乳酶原(365aa)→凝乳酶(323aa)天冬氨酸酶经胰蛋白酶在羧基未端水解，切除10多个aa肽，活力提高4-5倍用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。(二)酶分子的内部修饰退出②降低或消除酶的抗原性酶的抗原性与分子大小和分子结构有关酵母的烯醇化酶除去150个aa肽木瓜蛋白酶经亮氨酸肽酶除去2/3长度肽链枯草杆菌中性蛋白酶先用EDTA处理，透析并使该酶部分水解。了解酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶催化功能的贡献。退出酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。退出应用实例：1）提高酶活力：2）消除抗原性：退出2.2催化活性基团的修饰将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，但能水解高度活化的底物，如硝基苯脂。退出置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。通过两个途径实现化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。蛋白质工程：利用基因操纵技术。退出2.3肽链伸展后的修饰脲、盐酸胍处理使酶肽链充分伸展，修饰酶，然后复性（具有某种催化活性的构象）。Saraswothi等，先让酶变性，然后加入相应于所希望酶活力的竞争性抑制剂，待获得所希望酶的构象时，用戊二醛交联，以固定这个构象，然后透析除掉这种抑制剂。以丙酸作竞争性抑制剂，把核糖核酸酶制成一种“酸性酯酶”。退出3.1辅因子的共价结合NAD+衍生物共价结合到醇脱氢酶上之后，酶仍具催化活性构象，活力仍有使用过量游离NAD+时活力的40％，而且能抵抗AMP的抑制。解决辅因子再循环的有效方法！辅因子固定化后与固定化酶蛋白组合一起使用，（三）与辅因子相关的修饰退出3.2引入新辅因子或修饰过的辅因子次黄嘌呤→黄嘌呤黄嘌呤脱氢酶→黄嘌呤氧化酶二硫化四乙基秋兰姆（巯基专一试剂）将黄素溴衍生物与木瓜蛋白酶Cys25共价结合为黄素木瓜蛋白酶，其动力学可与黄素酶相比拟。退出3.3金属酶的金属取代通过改变酶分子中所含的金属离子，可以改变酶的专一性和稳定性等特性。氨基酸酰化酶：Zn酶对乙酰Ala的最适pH8.5，而Co酶为7.0；Co酶对N-氯乙酰Ala的水解活力增强，对N-氯乙酰Met的水解活力降低。超氧化物氧化酶：Fe-SOD中的Fe被Mn取代后，Mn-SOD对H2O2稳定性增强，对NaN3的抑制作用显著降低。退出举例：离子置换修饰方法①EDTA螯合金属离子②透析、超滤或分子筛层析，除去EDTA－金属螯合物③加入不同金属离子锌型蛋白酶→钙型蛋白酶：酶活力提高20-30%－淀粉酶的发酵生产、保存和应用过程中温－淀粉酶0.01MCa2+耐高温－淀粉酶1.25mM～1.75mMCa2+退出举例将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。退出第二节酶化学修饰的方法及修饰剂一、修饰剂的要求二、酶性质的了解三、反应条件的选择退出一、修饰剂的要求1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。（要求有较大的分子量）2．修饰剂上反应基团的数目及位置。（要求有较多的反应活性基团）3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件。退出二、酶性质的了解1．酶活性部位情况2．酶的稳定条件、酶反应最适条件3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。退出三、反应条件的选择1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例。2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。3．反应温度及时间。退出第三节酶分子的化学修饰方法一、酶分子侧链基团的化学修饰（一）几种重要的修饰反应酰化及其相关反应、烷化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应（二）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰如巯基的化学修饰、氨基的化学修饰、羧基、二硫键等（三）研究新热点亲和修饰（亲和标记、专一性的不可逆抑制：）退出小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。•侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。退出•几种重要的修饰反应：烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应退出氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺各种氨基酸侧链的修饰剂退出但解释修饰效果须十分小心，因为：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。退出1)专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。2)亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。亲和修饰退出化学修饰的专一性退出亲和修饰剂：①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。退出二、有机大分子对酶的修饰（一）、概念利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合