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第五章菌种保藏技术菌种保藏——把从自然界分离到的野生型或经人工选育的用于科学研究和工业生产的优良菌种，用各种适宜的方法妥善保存，尽可能保持其原来的性状和活力，使之不死亡、不衰退、不变异，且不被污染，以达到便于随时供应优良菌种给生产和科研进行研究、交换和使用。菌种保藏机构美国典型菌种收藏所（ATCC）美国农业部北方地区研究室（NRRL）日本大阪发酵研究所（IFO）荷兰微生物菌种保藏中心（CBS，1906年）法国里昂巴斯德研究所（IPL）英国国家典型菌种保藏所（NCTC）中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM1、普通微生物菌种保藏管理中心中科院北微所（AS）：真菌、细菌武汉病毒所（AS-IV）：病毒2、农业微生物菌种农科院土肥所（ISF）3、工业微生物菌种食品发酵所（IFFI）4、医学微生物菌种医科院皮研所（ID）：真菌卫生部检定所（NICPBP）：细菌医科院病毒所（IV）：病毒5、抗生素菌种医科院医药生物技术所（IA）四川抗研所（SIA）：新抗菌种华药抗研所（IANP）：生产菌种6、兽医微生物菌种农业部兽医药品监察所（CIVBP）中国典型培养物收藏中心（武汉大学）一、菌种保藏的基本原理在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，但又不至于死亡，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力，从而达到保藏的目的。菌种保藏的基本原理是使微生物的代谢作用降至极低限度，使其处于不活泼的休眠状态。微生物——典型菌种的优良纯种，最好是休眠体（芽孢）环境条件——低温、干燥、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。二、菌种保藏方法1、传代培养法2、悬液法3、载体法4、真空干燥法5、冷冻法1、传代培养法此法使用最早，它是将要保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4℃存放，定期进行传代培养、再存放。后来发展在斜面培养物上面覆盖一层无菌的液体石蜡，一方面防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面石蜡层可将微生物与空气隔离，减弱细胞的代谢作用，达到保藏菌种的目的。这种方法保藏菌种的时间不长，且传代过多易使菌种的主要特性减退，甚至丢失。因此它只能作为短期存放菌种用。2、悬液法这是一种将微生物细胞悬浮在一定的溶液中，包括蒸馏水、蔗糖、葡萄糖等糖液、磷酸缓冲液、食盐水等，有的还使用稀琼脂。悬液法操作简便，效果较好。有些细菌、酵母菌用这种方法能保藏几年甚至近十年的时间。3、载体法该法是使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。这种载体来源很广，如土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠或滤纸片等。该法操作通常比较简单，普通实验室均可进行。特别是以滤纸片（条）作载体，细胞干燥后，可将含细菌的滤纸片或滤纸条装入无菌的小袋封闭后放在信封中邮寄很方便。4、真空干燥法这类方法包括冷冻真空干燥法和L-干燥法。冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。L-干燥法不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10~20℃范围内进行真空干燥。5、冷冻法这是一种使样品始终放在低温环境下的保藏方法，包括低温法（-80~-70℃）和液氮法（-196℃）。溶液损伤——降温速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液的浓度提高，胞内的水分大量向外渗透，导致细胞剧烈收缩，造成细胞损伤。胞内冰损伤——冷却速度过快，胞内的水分来不及通过细胞膜渗出，胞内的溶液过冷而结冰，细胞的体积膨大，最后导致细胞破裂。因此，控制降温速率是冷冻微生物细胞十分重要的步骤。（1）保护剂：亦称分散剂，可以使细胞经低温冷冻时减少冰晶的形成。甘油、二甲亚砜、谷氨酸钠、糖类、可溶性淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、血清、脱脂奶等。二甲亚砜对微生物细胞有一定的毒害，一般不采用。甘油适宜低温保藏，脱脂奶和海藻糖是较好的保护剂，尤其是在冷冻真空干燥中普遍使用。可以通过以下两个途径来降低细胞的冷冻损伤：（2）玻璃化固体在自然界中有两种形式，即晶体和玻璃化。物质的质点（分子、原子和离子等）呈有序排列或具有格子构造排列的称为晶态，即晶体。反之，质点作不规则排列的则为玻璃态，即玻璃化。玻璃化不会使生物细胞内外的水在低温下形成晶体，使细胞不受损伤。实现玻璃化可以通过降温速率（106~107℃/s）和提高溶液浓度等途径实现。