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细胞迁移能力相关实验检测方法介绍@moldev.com1细胞的迁移运动不仅是细胞进行很多重要生理活动的基础，同时也是炎症反应和肿瘤发生等病理过程中的重要步骤和关键环节。细胞迁移(cellmigration)也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。目前人们对恶性肿瘤的研究是多方面的，从癌症的产生到转移，血管供给以及分裂增殖都一直是医学和生物学研究的热点。恶性肿瘤与良性肿瘤的最大区别就在于是否可以对周遭组织进行浸润，结果是形成边界不分明的癌组织，或是进入血管转移到远端（见远端转移）。根据观察可将癌症浸润分为四步。首先癌细胞表面的粘附分子会减少，与周围的细胞彼此分离，被“解除束缚”。同时癌细胞与基底膜的粘附却会增加，这是癌细胞通过增加自身基底面层粘连蛋白（laminin）受体实现的。然后癌细胞会释放蛋白酶，用以降解细胞外基质成分，如Ⅳ型胶原酶，使基底膜受损，产生缝隙。最后是癌细胞阿米巴运动样的迁移，钻过基底膜的缝隙，到达底下的间质组织。癌细胞此后会继续用蛋白酶为自己在间质组织开路，直到血管，然后它会以同样方式进入血管，经血到转移后，又以同样方式出管。因此，癌症的形成与肿瘤细胞的迁移能力密不可分，这也成为了一个诊断和治疗癌症的一个靶点。研究细胞迁移的方法有很多，比如划痕法、实时细胞追踪、Transwell和细胞芯片等，本文将一一介绍现今比较主流的与细胞迁移相关的实验方法。简介：细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养的单层细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各族细胞的迁移与修复能力。细胞划痕实验成本低，经常别用来检测贴壁生长的肿瘤细胞的侵袭转移能力。MolecularDevices的高内涵成像分析系统ImageXpress可以在有标记或无标记的情况下，对划痕区域的改变进行多时间点的实时检测和准确的定量分析，评价不同处理条件下肿瘤细胞侵袭转移能力的改变。细胞的运动迁移过程是细胞与细胞外基质相互作用的结果，迁移过程需要细胞的延伸、粘附、收缩过程在时间上和空间上的协调配合，同时细胞运动迁移过程也是肿瘤细胞形成和转移的基础。将HUVEC细胞种植于多孔板内，使用枪头刮擦多孔板表面，形成无细胞区域，加入SFM+FGF培养15小时后，用ImageXpress系统进行细胞迁移分析。划痕法图1所示为荧光染色细胞的划痕实验，图2为无标记透射光拍照及分析结果。2细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养的单层细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各族细胞的迁移与修复能力。细胞划痕实验成本低，经常别用来检测贴壁生长的肿瘤细胞的侵袭转移能力。MolecularDevices的高内涵成像分析系统ImageXpress可以在有标记或无标记的情况下，对划痕区域的改变进行多时间点的实时检测和准确的定量分析，评价不同处理条件下肿瘤细胞侵袭转移能力的改变。细胞的运动迁移过程是细胞与细胞外基质相互作用的结果，迁移过程需要细胞的延伸、粘附、收缩过程在时间上和空间上的协调配合，同时细胞运动迁移过程也是肿瘤细胞形成和转移的基础。将HUVEC细胞种植于多孔板内，使用枪头刮擦多孔板表面，形成无细胞区域，加入SFM+FGF培养15小时后，用ImageXpress系统进行细胞迁移分析。图1FGF诱导的内皮细胞层迁移。A：生长因子诱导细胞信号转导，调节迁移模块，影响内皮细胞迁移示意图；B：实验流程；C：AlexaFluor594标记HUVEC细胞，血清培养15分钟和15小时并固定染色的结果。D：持续观察20小时，并通过细胞迁移分析的动力学分析结果；E：不同浓度FGF处理后细胞迁移分析结果。图1所示为荧光染色细胞的划痕实验，图2为无标记透射光拍照及分析结果。3图2多时间点划痕迁移无标记检测及结果图3Transwell小室模式图Transwell小室（Transwellchamber，Transwellinsert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Tran-swell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状、不同大小，根据实验需要，可有不同选择。将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。Transwell小室法4应用Transwell小室可评价细胞迁移的能力，即将细胞接种在上室，经过一段时间的培养（如24h或38h）后，检测膜下表面的细胞个数，穿过滤膜的个数与细胞迁移能力成正比。对人肝肿瘤细胞HepG2是重要的实验细胞株，具有较强的侵袭转移能力。筛选可抑制HepG2细胞的化合物对治疗肝癌有着重要的作用。HepG2细胞消化后重悬于1%血清培养基中，种于上室，下室中为10%血清培养基。6小时后，将下室培养基更换为加入100nM化合物的完全培养基。继续培养24小时，将小室膜固定，用棉签擦去膜上表面细胞，用DAPI染色。最后使用MolecularDevices的高内涵成像分析系统ImageXpressXLS采集图像并进行分析。图5为小室膜下层细胞的照片及分析时的蒙板图片，照片为10X物镜下采集，每个孔采集了9个视野。通过图5的统计数据可以看出，筛选出的三个化合物对HepG2细胞的迁移能力均有显著抑制作用，Cpd1和Cpd2的抑制作用更强。图4迁移实验原理模式图图5Cpd1、Cpd2、Cpd3对人肝肿瘤细胞HepG2迁移能力的影响。DACountMaskControl10nMCpd110nMCpd210nMCpd35Transwell小室除了可以做迁移实验，还可以应用到侵袭及趋化的研究中去。做侵袭实验时，Transwell上室的滤膜被Matri-gel（主要成分为层黏连蛋白和胶原）覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Matrigel的滤膜，此模型为模拟体内环境而设计。而做趋化实验时，靶细胞在滤膜上面，趋化因子在下面，细胞沿着趋化因子的梯度穿过模孔。由于Transwell小室的特殊设计，使其更接近体内环境，细胞在滤膜上生长，形态和功能上都更接近体内细胞状态，是一个操作简单的实验模型。ControlCpd1Cpd2Cpd3020040060080010[nM]*********MigrationCellNumber图5Cpd1、Cpd2、Cpd3对人肝肿瘤细胞HepG2迁移能力抑制作用柱状图。图6细胞长时间培养和动态观察单细胞实时追踪迁移检测特别适用于对一些涉及单细胞迁移的生理病理活动的研究，如炎症反应，免疫反应和肿瘤迁移等。以（t,X,Y）坐标来定位单个细胞，通过跟踪细胞的整个运动过程来建立细胞运动轨迹，由此对细胞的动力学特征进行定性定量表征，比如细胞运动的距离、速度、方向、迁移的持续时间等。对单个细胞移动进行测量，可以将细胞迁移与细胞生长这两个因素的影响区分开来，这给分析某些特定影响因素（如抗肿瘤迁移药物）在细胞迁移中的作用带来方便。在对群体细胞迁移运动测量中，不同区域的细胞状态不一，或者细胞对某些特定刺激的反应不相同，以及细胞增殖生长等因素均可能会对细胞群体的迁移产生影响，而通过对单细胞运动状态跟踪测定这些复杂影响很容易被区别和量化表征。MolecularDevices的高内涵成像分析系统ImageXpress具有可控制温度、湿度和CO2浓度的活细胞培养装，可以实现长达7天以上的活细胞实时观察，并可以对单个细胞实时追踪，进行细胞追踪分析后，能够生成细胞移动轨迹，并能计算细胞移动的角度、速度、移动距离等多个参数，这些参数既能生成图表，也能将数据导出。实时追踪细胞轨迹法6图7单细胞运动轨迹及追踪结果图8细胞芯片筛选miRNA流程图高内涵成像系统以通量高、数据量大、数据准确著称，若结合芯片技术，则通量又可以成倍的增加。北京大学席教授实验室整合了高内涵成像和细胞芯片技术筛选miRNA与细胞迁移的关系，文章被发表在NatureCommunications上（Genome-widefunctionalscreeningofmiR-23basapleiotropicmodulatorsuppressingcancermetastasis）。实验中，将聚合材料铺在玻璃板上，干燥凝固后用shadowmask磨具的罩子蚀刻出微型孔，再把miRNA加到孔中，种上细胞，因为细胞可以在玻璃上生长但不能在聚合材料上贴壁，所以细胞就长在微型孔里，将聚合材料层除去，就形成了图中的细胞芯片，经过一定时间的生长，细胞由于增殖与迁移，从微孔中长到外面，通过高内涵的成像及分析功能计算细胞的位置变化，就得到了miRNA影响细胞迁移的数据，如图8所示。高通量细胞芯片法扫一扫关注我们的官方微信MolecularDevices大中华区Email:info.china@moldev.com上海电话:86-21-33721088传真:86-21-33721066地址:上海市徐汇区宜山路1388号民润大厦8楼201103北京电话:86-10-64108669传真:86-10-64108601地址:北京市朝阳区广渠东路3号中水电国际大厦612&613室100124成都电话:86-28-65588820传真:86-28-65588831地址:成都市锦江区东御街18号百扬大厦2208室610016台北电话:886-2-26567585传真:886-2-28948267地址:台北市内湖区堤顶大道二段89号3楼香港电话:852-2248-6000传真:852-30102828地址:香港皇后大道东1号太古广场三座4楼406-9公司简介MolecularDevices始创于上世纪80年代美国硅谷，作为全球高通量仪器设备的领导者，一直致力于为生命科学研究及药物研发提供最先进的全方位解决方案。其产品覆盖微孔板检测分析、高通量筛选、高内涵成像、高效克隆筛选等。公司以持续创新、快速高效、一流质量的产品及完善的售后服务著称业内。MolecularDevices为您提供高性能的分析检测系统，加快和改进药物研发及基础生命科学的研究。我们的产品几乎可以满足所有通量、内涵以及预算的需求。除了科研单位和部门外，我们还帮助制药和生物技术企业从分子、细胞和系统水平去了解各项生物功能，研究开发新的治疗方法。MolecularDevices于近几年收购了UniversalImagingCorporation(2002年)、AxonInstruments(2004年)、BlueshiftTechnologies(2008年)和Gene