转基因植物(精)

植物转基因技术转基因植物技术•是指利用基因工程技术，在离体条件下，对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重载体转入受体中，并使其在体内表达的植物。•转基因植物通常具有高产优质、抗病虫、环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高某些成分的含量等优良性状。1.植物转基因技术的基本路线2.农作物基因工程（抗虫、抗病毒﹑抗除草剂﹑转基因作物，提高作物产量与品质）二、植物转基因技术的基本路线1.目的基因的分离2.载体构建3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA4.对植物组织或细胞进行转化5.植株再生6.转基因植株的鉴定7.转基因植株的种植(一)目的基因的获取1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成二.基因表达载体的构建-----------核心基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端三、外源基因导入植物的方法（一）DNA直接转移法1）化学刺激法PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙等化学试剂等处理原生质体，可使其捕获外源DNA。2）电击法在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿，使得外源DNA容易进入细胞内。原生质体不受伤害，而且膜孔可恢复。3）显微注射法借助显微注射仪，将外源DNA通过机械方法直接注射到受体细胞。4）基因枪法基因枪法，也称微粒轰击法，是将DNA包被到金粒或钨粒中然后把这些粒子加速推进靶细胞。优点是转化受体迅速简单、取材广泛，不受基因型限制，金属微粒的喷射面广，植株可育性高，转化频率高等。5）脂质体介导法是将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。6）微激光束法利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。7）花粉通道法将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年Smith和Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。（二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后，T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中。Ti质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转基因奠定了基础。T-DNA的长约23Kb，在其两端各有一个25bp左右的正向重复序列，称之为T-DNA的边界序列。在不同的农杆菌Ti质粒上该序列高度保守，一般认为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡筛选培养基愈伤组织分化幼苗四、转基因植物的筛选与检测无论使用哪种转基因方法，转化细胞与非转化细胞相比都只占少数。为获得真正的转基因植株，进行基因转化后的第一步工作是筛选转化细胞。在含有选择压力的培养基上诱导转化细胞分化，形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形成转化植株。第二步是对转化植株进行分子生物学鉴定。第三步则是进行性状鉴定及外源基因的表达调控研究。报告基因•报告基因是用来筛选和指示转化细胞，组织和转基因植物的有效标记。•根据报告基因编码特点，分为两类，抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因或发光基因。•报告基因由于其表达产物易于检测，已广泛应用于转基因植物中。1.（一）抗性基因一般用抗性基因来富集转化细胞。抗性基因应满足以下几点：1.抗性基因应是显性基因。2.在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非转化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集。3.抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或发育有抑制作用。4.选择物价廉易得。1.抗生素抗性基因1.npt新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、巴龙霉素、新霉素具有抗性。2.aphIV潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性。3.spt链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性。4.cat氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗生素活性。等等。2.抗除草剂基因•除草剂抗性基因在植物遗传转化中可同时用作选择标记和培养抗除草剂的作物。•抗除草剂基因主要有抗PPT的bar和pat基因以及抗草甘膦的epsps基因。（二）显色或发光报告基因•1.GUS基因•2.荧光素酶基因•3.GFP基因•报告基因仅用于筛选转化体，因为报告基因是在染色体上，只能间接证明目的基因转入植物细胞，要获得目的基因转化及表达的直接证据，还需要进行生物学检测。2.分子生物学检测方法1.酶联免疫吸附检测酶联免疫吸附检测是指利用外源基因表达蛋白的抗体与抗原的特异性，通过结合在抗体上的酶作用于特定的底物后发生显色反应，借助比色鉴定转基因植物。可经免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布。2.PCR技术检测是根据转基因植物中外源基因的特点，设计并合成相应的引物，以转基因植物DNA为模板进行PCR扩增反应。如PCR扩增反应的产物与外源基因片段相同，表明该植物为转基因植物。PCR检测DNA用量少，操作简单，快速灵敏，不需用同位素即可完成。应用PCR检测易出现假阳性，可用PCR－Southern杂交进一步验证。3.分子杂交检测利用探针与其互补的核苷酸序列杂交后，就可以从诸多的核苷酸序列中检测出与其互补的序列，因而分子杂交是重组子鉴定以及检测外源基因整合与表达的强有力的手段。它是证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠方法。转基因植物分子杂交包括两部分，一是核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交及Northern杂交。二是属于蛋白质分子“杂交”的western杂交。一、抗病虫害的转基因植物将抗虫基因导入农作物是植物基因工程的得意之笔，能避免化学杀虫剂所造成的许多负面影响。目前，抗虫作物已占全球转基因作物的22％。用于构建抗虫害转基因植物常见的外源基因有苏云金芽孢杆菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、几丁质酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多个，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因应用最为广泛。二.抗虫转基因植物•苏云金杆菌（Bt）毒素蛋白基因有四种：I,II,III,IV•I型毒素蛋白抗鳞翅目昆虫•II型毒素蛋白抗鳞翅目核双翅目昆虫•III型毒素抗鞘翅目昆虫•IV型毒素抗双翅目昆虫三.抗除草剂作物谷氨酰胺合成酶GS在植物的氨同化及氮代谢过程中起重要的作用，对氨具有很高的亲和力，是植物体内唯一能够解除由硝酸盐还原、氨基酸代谢及光呼吸中释放出来的氨毒性的解毒酶。PPT能够强烈抑制GS，从而导致细胞内氨的含量的迅速积累。而氨的积累直接抑制光系统I和光系统II反应，减少跨膜PH梯度，使光合磷酸化解耦联，随之叶绿体结构解体，整个植物死亡。而PPT是目前广泛使用的除草剂的成分，杀草谱广，对植物的地上部分和地下部分均有枯杀作用，在土壤中易被代谢分解，残留期短，半衰期只有2－3天。bar基因编码PPT乙酰转移酶，催化乙酰辅酶A的乙酰基转移到PPT的氨基上，形成乙酰PPT，而使PPT失活。抗除草剂的水稻四、高产高品质的转基因植物•将不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸•提高粮食中必需氨基酸的含量•提高粮食中铁元素和维生素的含量•延长棉花纤维的长度