基因功能分析的基本策略

第十二章基因功能分析的基本策略转基因模型是研究基因功能的主要手段转基因生物：外源基因导入生物体表达。基因打靶：外源基因替换内源基因。基因敲除。基因敲入。基因沉默：导入特定基因，抑制内源性基因表达。第一节转基因技术转基因技术(transgenictechnology)：将外源基因导入细胞，随机整合到受体基因组内，并随细胞分裂而遗传给后代。细胞模型。转基因动物。转基因植物。一.转基因生物的意义20世纪80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。转基因生物的用途：研究手段：疾病的转基因动物模型。改良动物性状：抗病性、耐寒性等。生产产品：抗体、疫苗等的生产。二、基本原理构建携带目的基因的载体。外源基因导入：将目的基因通过显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中。使目的基因整合到基因组中。将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中。使其发育成携带外源基因的转基因动物。基本原理供体基因受体的受精卵基本原理转基因的受精卵基本原理转基因动物基本过程上游—基因改造和载体构建中游—基因转移、胚胎移植与建系下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选1.上游—基因改造和载体构建外源基因:完整的转录单位,由顺式作用元件、结构基因和转录终止信号组成。报告基因(reportergene):在表达载体中引入易于检测的提示重组体存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):将特定的目的基因与报告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完整的转录单位。动物转基因常用的载体腺病毒载体逆转录病毒载体非病毒类载体：如质粒等。2.中游—基因转移、胚胎移植与建系基因导入技术：物理、化学和生物学方法1)显微注射法（microinjection)2)胚胎干细胞法（embryonicstemcells,ES细胞）3)逆转录病毒感染法4)精子载体法1)DNA显微注射法制备超量受精卵。DNA显微注射。转移注射卵到输卵管或子宫。转基因鼠的鉴定及鼠系建立。DNA显微注射持卵管DNA注射针精原核卵原核DNA显微注射DNA显微注射到尚未发生核融合的受精卵的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原核大，容易辨别。线性DNA整合效率比超螺旋DNA高出数倍，因而用于显微注射的转入基因通常是去除载体序列的线状DNA。DNA显微注射法的特点DNA大小无限制，最大可达250Kb。随机整合：在染色体上整合的位点是随机的，整合的拷贝数也不一定。转入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢。总效率较低(实际成功率1/1000)。提高显微注射DNA表达的成功率转入的外源基因要能够高效表达，最好是可以诱导表达。转入基因中应该包含有帮助提高整合效率的序列，如微卫星序列。微卫星序列微卫星序列诱导表达启动子外源基因2)胚胎干细胞法胚胎干细胞(embryostemcells,ES细胞)：可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他类型细胞的能力。ES细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分化特性。胚胎干细胞法分离和培养ES细胞。外源基因导入ES细胞。导入外源基因的ES细胞的子宫转移。转基因鼠的鉴定及鼠系建立。胚胎干细胞的分离和培养胚泡培养皿中分离胚泡内层细胞胰蛋白酶消化解离加饲养层细胞培养胚胎干细胞胚胎干细胞的分离和培养胚胎干细胞外源DNA的导入DNA胚胎干细胞囊胚原囊胚转基因动物磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法微注射外源DNA的整合用于ES细胞的DNA载体一般带有定点整合元件,避免了随机整合。定点整合位点应选择在基因组内编码非必需产物的地方，以减少整合对细胞正常功能的影响。定点整合位点必须在基因组的可以进行转录的地方。胚胎干细胞法的特点定点整合。ES细胞在体外培养，外源DNA导入后可用正-负选择法筛选择正确整合的ES细胞,相对较简单。目前只在小鼠身上获得成功。3）逆转录病毒感染法逆转录病毒载体的构建获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚外源DNA导入早期胚胎：获得病毒颗粒感染早期胚胎包装细胞与早期胚胎共培养感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育成携带外源基因的动物。逆转录病毒感染法外源基因逆转录病毒载体逆转录病毒感染四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚嵌合小鼠纯合体小鼠逆转录病毒感染法的特点通过病毒DNA插入宿主DNA的机制，将外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率高。反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(＜10kb)。对家禽类的转基因研究有重要意义。4）精子载体法外源DNA精子卵细胞受精卵转基因动物共育法脂质体转染法电穿孔法DNA精子受精卵DNA卵细胞DNA胚胎干细胞DNA逆转录病毒感染磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法四细胞胚胎囊胚原肠胚转基因动物微注射显微注射3.下游—基因整合与表达检测及筛选染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。转录水平：转基因的mRNA的存在与否以及表达水平。蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。鉴定方法PCRSouthernblot染色体原位杂交NorthernblotRT-PCRWesternblot基因转移鼠纯合鼠系的建立×转基因杂合鼠未转基因鼠生殖系细胞中不含转入基因生殖系细胞中含转入基因子代多次交配可得到纯合转基因鼠系三、转基因动物的应用分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能。建立人类疾病的转基因动物模型。基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。人类疾病的转基因动物模型完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段。人类疾病的转基因动物模型各种人类遗传病的鼠模型，如：老年性痴呆症(Alzheimer’sdisease)、关节炎(arthritis)、肌肉营养缺乏症(musculardistrophy)、肿瘤发生(tumorigenesis)、高血压(hypertension)、神经退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、内分泌功能障碍(endocrinologicaldisfunction)、动脉硬化症及其他很多疾病。利用转基因动物反应器生产药用蛋白转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物反应器等。抗凝血酶III：转基因绵羊的乳汁中。β乳球蛋白红细胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生长激素转基因改良移植器官改造异种来源器官的遗传性状，使之适应于人体器官或组织的移植。1997年起，利用遗传改良的转基因猪肝做为严重肝病患者的离体生命支持物。动物的克隆1996年，首次实现动物的无性生殖。由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供细胞质发育而来。核移植技术（NuclearTransfer)核移植技术（NuclearTransfer)第二节基因打靶基因打靶(GeneTargeting)：通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究此基因的功能。基因敲除(geneknockout):将某个基因定向去除。基因敲入(geneknockin):定向将一段基因序列替代另一段基因序列。一、基因打靶的基本程序打靶载体的构建。打靶载体导入ES细胞及其鉴定。基因敲除ES细胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宫。嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。1.打靶载体的构建同源基因片段质粒载体HB1HB2neor基因HSV-tk基因2.打靶载体导入ES细胞磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法脂质体转染法显微注射法打靶载体的正-负选择与整合位点两端区域同源的两段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor基因）。2个不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分别来自I型II型单纯疱疹病毒。打靶载体的正筛选tk1HB1neorHB2tk2载体载体同源重组neorG418正筛选，细胞存活染色体染色体打靶载体的负筛选tk1HB1neorHB2tk2染色体染色体非特异性整合GCV负筛选，细胞死亡PCR鉴定在打靶载体的HB1和HB2之间，加上一个载体和鼠的基因组中都没有的独特DNA序列（US）。如发生随机整合，PCR无法扩增出预期的DNA片段。如果整合于特定位点时，则PCR可以扩增出预期大小的片段。PCR鉴定：特异整合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反应有特异条带特异整合基因敲除小鼠的获得基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫嵌合体的杂交育种：同源重组只发生在一条染色体上，因而同源重组后只能得到嵌合体，将嵌合体杂交，即可得到纯合子。×基因敲除和RNA干扰基因敲除是在基因水平将某个基因定点去除，动物整体水平。RNA干扰不是敲除基因，而是诱导RNA的特异性降解，干扰基因的表达。一般是在细胞水平。第三节RNA干扰1990年，Jorgense等通过转基因改造牵牛花颜色。外源基因不但不能加深花的颜色，反而造成内源基因表达的降低。RNA干扰是dsRNA导致的基因沉默1998年，Fire等在C.elegans中用antisenseRNA抑制基因表达。dsRNA比sense或antisenseRNA都好。注射甚至口服dsRNA都能诱发基因沉默。很少量的双链RNA就能诱发C.elegans整体的基因沉默，甚至能传递到子一代。RNA干扰：RNAinterference(RNAi)RNAi是真核生物中广泛存在的现象植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白(GFP)基因被抑制，显露出红色。线虫：左侧为GFP转基因线虫；右侧线虫则经GFPdsRNA处理。部分细胞RNAi相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。Hela细胞：经ORC6siRNA作用后，细胞出现多核现象。绿色为tubulin，红色为DNA。ORC6细胞分裂调控蛋白。果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为shRNA造成的色素缺乏的缺陷型。RNA干扰RNA干扰：双链RNA诱导的同源mRNA降解。RNA干扰技术可以用于基因敲除，选择性关闭特定细胞基因。siRNA的产生Dicer：RNaseIII的一种，可降解dsRNA成siRNA。ShortinterferingRNA(siRNA)：21~23ntsiRNA诱导同源序列的降解RNA-InducedSilencingComplex产生两种后果：同源mRNA的降解。同源mRNA翻译受阻。基因沉默的机制是多方面的dsRNA造成的mRNA降解。Post-translationalgenesilencingdsRNA造成同源性基因的甲基化和表达关闭。dsRNA造成染色质结构变化。dsRNA对蛋白质的合成产生影响。RNAi和基因敲除在基因组DNA上，通过同源重组进行的基因敲除。在mRNA水平进行的基因敲除：AntisenseoligonucleotidesRibozymeRNAinterference：dsRNA；siRNA；shRNAdsRNA能够诱发细胞的抗病毒反应在哺乳动物存在干扰素相关的抗病毒体系。dsRNA激活dsRNA-dependentproteinkinase(PKR)，进一步诱导非序列依赖的内源性RNA降解。在胚胎期细胞，上述非特异的抗病毒体系尚未形成。通过dsRNA可以诱导序列特异的RNAi。siRNA与shRNA30bpsiRNA可以诱导RNAi，并克服哺乳细胞的障碍。ShorthairpinRNA：(shRNA)可达成稳定的基因敲除。shRNA表达载体系统miRNA表达载体系统siRN