电镜生物样品制备技术

第五章扫描电镜生物样品制备技术第一节常规生物样品SEM制备技术FeaturesofSEM高分辨率FeaturesofSEM强立体感FeaturesofSEM广泛的放大倍率FeaturesofSEM应用范围广生物、医学、动物、材料、化学、物理、地质、冶金、矿物、污泥(杆菌)、机械、电机及导电性样品如半导体电子材料等材料学土聚水泥制备扫描电镜样品的总要求在不损伤样品原始结构状态的情况下，保证样品的体积和表面积不发生改变，充分暴露样品表面的微细结构。生物样品的特性含水量高质地柔软导电性差二次电子产率低对热、电子束等敏感扫描电镜生物样品要求：不含水份具有较高的二次电子发射率良好的导电性耐热性最大限度的保持样品的形貌扫描电镜样品常规制备的操作程序1.取材2.清洗3.固定4.脱水5.干燥（置换）6.粘托7.镀膜（导电处理）一、取材要点：确定观察样品的目标要求及注意事项：做好充分准备（试剂、仪器、器械等）保护观察面，作好标记速度要快，每次取材数量不宜过多大小要合适10×10×5毫米避免拉割、挤压二、清洗目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面方法：物理方法:漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。化学方法:用酶消化法注意事项：在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型清洗液的选择一般组织：等渗生理盐水游离组织细胞：缓冲液、等张液表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：低浓度蛋白水解酶组织培养细胞：组织培养液特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，选用去垢剂TritonX-100）三、固定目的：保存样品表面的真实结构；硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品的损伤；提高样品的二次电子发射率；提高样品的耐热性和导电性。常用的固定剂：2.5%戊二醛（1～3h)1.0%四氧化锇(30’~1h)固定温度：室温，一般以4℃为宜。四、脱水要求：不改变样品的体积和表面积的情况下，去除样品中的水份。常用的脱水剂：乙醇、丙酮方法：梯度脱水时间：视样品大小而定注意事项：避免裸露，夹伤五、干燥目的：去除样品中的脱水剂方法：空气干燥法、冷冻干燥法、叔丁醇干燥法、临界点干燥法等常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法空气干燥法方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度，退回至85%脱水剂，取出，空气中自然干燥。优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程中减少了样品的收缩及损伤缺点：常常使样品发生变形收缩适用范围：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫等含水量较少的样品冷冻干燥法方法：将含大量水分的生物样品迅速投入液氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。优点：不存在气相与液相间的表面张力问题，故对样品损伤较小。缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤，费时。适用范围：含水量较多的生物样品叔丁醇干燥法（1）乙醇梯度脱水至100﹪/2次（2）叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇70﹪、80﹪、90﹪、95﹪和100﹪/2次5-10min/次（3）在样品表面滴上100%叔丁醇（4）将标本置于4℃以下使样品快速固化（5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。临界点干燥法原理：利用物质在临界状态时，气相与液相的界面消失，样品在没有表面张力的情况下进行干燥。步骤：脱水置换（醋酸异戊酯）预冷放入样品注入液态CO2CO2置换CO2加温气化排除CO2温度：31.4度压力：73个大气压临界点干燥法空气干燥法Comparisonbetweencriticalpointdryingandairdrying六、粘托SEM样品在干燥处理或金属镀膜之前，需用特制导电胶或双面胶将样品粘贴在金属样品台上。导电胶一般具有黏着力较强、容易挥发固化、干燥后表面电阻率低、导电性能好等特点。要点：稳，钝角样品粘托Fixingthespecimen七、镀膜（样品的导电处理）目的：使样品导电，增加二次电子的发射率金属镀膜技术：包括真空喷镀法和离子溅射法真空喷镀法方法：在高真空中使金属加热蒸发，在样品表面沉积形成一层金属膜。缺点：金属损耗大，容易产生污染和热损伤，容易形成“死角”。离子溅射法原理：利用气体在低真空中的辉光放电所产生的高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，所以在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属膜。离子溅射的优点：要求的真空低工作温度低金属粒子无方向连续的、厚度均匀甲虫3kV大肠杆菌耳蜗尿酸钠结晶红细胞巨噬细胞吞噬上左：兔肾小体细胞上右：血细胞发生下图：十二指肠绒毛SEM觀察苗木下表皮氣孔分佈及葉部組織之微細構造A：氣孔密度(橫線=120mm)B：氣孔形態(橫線=12mm)C：葉組織(橫線=120mm)ABCSEM觀察泡桐根瘤線蟲微細構造SEM觀察A.scrobiculata孢子之外觀形態(橫線=60mm)SEM觀察G.mosseae丛枝菌根真菌孢子之外觀形態(橫線=100mm)接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造(A：橫線=30mm；B：橫線=12mm)未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造(A：橫線=300mm；B：橫線=12mm)TRRTT.harzianum(T)寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形松材線蟲頭部口針松材線蟲(雄)松材線蟲(雌)白粉病分生孢子麻竹墊銹菌孢子第二节扫描电镜特殊样品制备技术特殊生物样品制备主要有：（1）管道铸型样品（2）冷冻断裂样品（3）游离细胞样品（4）组织消化样品1.管道铸型样品用于研究血管淋巴管胆管等空腔性脏器的立体结构关系和内表面结构。铸型方法:铸型剂灌入管腔硬化成型后将组织腐蚀去掉处理铸型进行观察铸型处理：干燥喷镀观察2冷冻断裂样品用于实质性脏器内部组织结构的研究，观察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间的关系。步骤：取材固定清洗防冻冷冻包埋割断软化后固定导电及终末固定脱水临界点干燥镀膜观察要求：取材迅速，大小为1×1×5mm，用具要预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要快，外力要轻3游离细胞样品样品制备要点：将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、固定步骤：预固定离心涂片固定脱水干燥镀膜血细胞4组织消化样品用化学腐蚀或酶消化方法，来充分暴露和显示被检样品结构的表面形态。步骤：固定清洗消化表面稳定后固定脱水干燥镀膜观察谢谢！谢谢！