分子荧光分析法.ppt

1化学分析（Ⅱ）第十一章荧光分析法2基本要求掌握分子荧光的发生过程，激发光谱和发射光谱，荧光光谱的特征，分子结构与荧光的关系；影响荧光强度的因素，荧光定量分析方法。熟悉分子从激发态返回基态的各种途径，荧光寿命与荧光效率。了解荧光分光光度计与其他荧光分析技术。3处于基态的分子吸收能量被激发至激发态，然后从不稳定的激发态释放能量返回至基态。如果通过碰撞以热能或动能的形式释放能量回到基态，称为无辐射跃迁；如果是以辐射(发射光子)的形式回到基态，此种现象称为光致发光。常见的光致发光包括荧光和磷光。概念4荧光分析法定义：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。待测物质分子荧光原子荧光激发光的波长范围紫外-可见荧光红外荧光X射线荧光分类：5荧光分析法的特点灵敏度高：检测限0.0001µg/mL,比分光光度法高2～4个数量级。（在黑背景下检测；光源的强度大）选择性高：适当选择激发光的波长和荧光测定的波长；应用荧光寿命的差别–时间分辨技术。6MFS与UV/Vis法比较：原理UV/Vis吸收MFS发射测定方法I0ItF灵敏度,选择性10-5～10-6mol·L-110-7～10-9mol·L-1I0F71575年，西班牙医生N.Monardes发现。1852年，SirGeorgeStokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。1867年，首次用于分析测定。1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。1952年，商品荧光分光光度计出现。8第一节荧光分析法的基本原理一、分子荧光二、荧光与分子结构三、影响荧光强度的外部因素9一、分子荧光（一）分子荧光的产生1、分子的电子能级与激发过程分子的多重性M:M=2s+1，s表示总自旋量子数，s=0时分子所处的电子能态为单重态，用S来表示；s=1时分子所处的电子能态为三重态，用T来表示；10光吸收过程失活过程发光失活分子间能量转移失活非辐射失活荧光磷光振动驰豫内转换外转换系间跨跃2.荧光的产生11吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间跨跃振动驰豫外转换基态荧光寿命:10－9～10－7s磷光寿命:10－4～10s图11-2荧光和磷光产生示意图12辐射跃迁－发光失活•荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。•磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。•波长关系：激发光＜荧光＜磷光。13无辐射失活a.振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高b.内转换：当两个电子能级非常接近以致其振动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级的过程。14无辐射失活c.外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间发生相互碰撞而失去能量的过程。d.系间跨越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。15吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间跨跃振动驰豫外转换基态荧光寿命:10－9～10－7s磷光寿命:10－4～10s图11-2荧光和磷光产生示意图16结论：•荧光是来自最低激发单重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象，发光过程的速率常数大，激发寿命短；•磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象，发光过程的速率常数小，激发寿命相对比较长。17复习：荧光的产生基态分子hv激发态回到基态，如何回去？18S2S0S1T1l2l1分子的吸收情况19S2S0S1T1l2l1振动弛豫：在同一电子能级（激发态）…特点：无辐射；速率快（10-14～10-12s内完成）20S2S0S1T1l2l1内转移（internalconversion)：相同多重性的两个电子能级之间的非辐射跃迁21S2S0S1T1l2l1l3荧光发射Fluorescence22l1l2l3l3l1l2Onlyl323S2S0S1T1l2l1系间跨跃磷光发射l4IntersystemCrossingPhosphorescence24S0S1T1l2l1外转移ExternalConversion25复习分子荧光的发生过程基态分子概念：基态、激发态（激发单重态S*、激发三重态T*）能量传递过程：1、无辐射跃迁（振动弛豫、内转换、外转换、系间跨越）2、辐射跃迁（荧光、磷光）26吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间跨跃振动驰豫外转换基态荧光寿命:10－9～10－7s磷光寿命:10－4～10s图11-2荧光和磷光产生示意图27（二）荧光的激发光谱和发射光谱荧光物质分子都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱（荧光光谱）。激发光谱：不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。荧光光谱：在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。图11-3蒽的激发光谱和荧光光谱28激发光谱和发射光谱具有三个特点：⑴斯托克斯位移，波长：荧光＞激发光；⑵荧光发射光谱的形状与激发光波长无关；⑶荧光光谱和激发光谱大致成镜像关系。图11-3蒽的激发光谱和荧光光谱29蒽的激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光光谱)激发光谱:ExcitationSpectrum,激发波长:lex发射光谱EmissionSpectrum,发射波长:lem图11-3蒽的激发光谱和荧光光谱b0b1b2b3c3c2c1c030二、荧光与分子结构（一）荧光寿命和荧光效率荧光寿命(τf)：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间称为荧光寿命(10-8∼10-10s)。荧光物质受到一个极短时间的脉冲光激发后，荧光强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示Ft=F0e-Kt，推导得lnF0/Ft=t/τfF0、Ft：开始时和t时的荧光强度，K为衰减常数。31吸收激发光的光子数发射荧光的光子数荧光产率荧光效率(f)：又称为荧光量子产率或荧光产率。32（二）有机化合物分子结构与荧光的关系1.共轭效应→*跃迁芳香族化合物、五元杂环上取代苯基.共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.─(CH=CH)3─φ=0.68─(CH=CH)2─φ=0.28332.刚性结构和共平面效应酚酞(无荧光)8－羟基喹啉(弱荧光)红色荧光CO-OOCOO-COCOO--ONO-NOMgNO荧光黄34联二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(强荧光物质)CH235O3SN(CH3)2N(CH3)2SO3Ff＝0.75Ff＝0.03扭转离开了平面构型，影响了p-共轭作用36顺式二苯乙烯无荧光反式二苯乙烯强荧光CHCHCHCH373.取代基的作用给电子基增强荧光：－OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N吸电子基减弱荧光：－COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I与体系作用小的取代基影响不明显：－SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。COOHNO2I无荧光NH2OH比荧光强50倍38取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光:碱性有荧光COOHOH无荧光OHCOOH水杨酸中性、碱性均有荧光OHOHCO39（三）荧光试剂荧光胺邻苯二甲醛（OPA）1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（Dansyl-Cl，丹酰氯）测定无机离子的荧光试剂40有机化合物的荧光分析(1)荧光胺(2)邻苯二甲醛(3)丹酰氯OOONOOHORR－NH2HOOC荧光胺荧光胺衍生物荧光胺及其水解产物不显荧光荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺类形成的衍生物有高强度荧光41NOHHOOHN=NHOSO3Na8－羟基喹啉(Al,Be等)茜素紫酱R(Al,F-等)用于测定无机离子的有机试剂CCOOHH安息香(B,Zn,Ge,Si等)黄酮醇(Zr,Sn等)OOHO42三、影响荧光强度的主要因素内部因素：分子结构对荧光效率的影响外部因素：外界条件对荧光效率的影响43内部因素：分子结构对荧光效率的影响。物质分子有强的紫外吸收和一定的荧光产率是发射荧光的两个必备条件。分子结构中有π→π﹡跃迁（K带强吸收）或n→π﹡跃迁（R带弱吸收）。⑴长共轭结构：分子中必须具有大的共轭π键结构。共轭度越大，发射波长长移，发光强度增加。⑵分子的刚性和共平面性：具有刚性平面性结构的分子荧光量子产率高。⑶取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而吸电子取代基则使荧光强度降低。1.内部因素44长共轭结构示例femex(nm)/(nm)/λλ比较：苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36CH2OCOCH3维生素Aλex＝327nm；λem＝510nm45刚性和共平面结构示例形成络合物后，如果分子的刚性和共平面性增强，可使荧光增强。联苯f＝0.2芴f＝1.0NOHNOMg8-羟基喹啉8-羟基喹啉镁46空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强烈荧光，而顺式无荧光。①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐f＝0.75f＝0.03SO3NaNH3CCH3SO3NaNH3CCH347取代基作用第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。如：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－CN等。第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(卤素原子序数↑，荧光效率↓)等。第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明显。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。48表苯环上取代基对荧光的影响化合物分子式λF/nm相对荧光强度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚阴离子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正离子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-049外部因素：外界条件对荧光强度的影响⑴温度的影响：温度降低会使荧光强度增大；温度升高荧光强度减小。⑵溶剂的影响：溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长长移；溶剂的黏度减小，荧光强度减弱。⑶pH的影响：对于弱酸或弱碱性荧光物质，溶液的pH值改变，影响其解离平衡，使荧光强度发生变化。⑷荧光熄灭的影响：荧光物质与荧光熄灭剂相互作用，引起荧光强度降低。⑸散射光的干扰：瑞利光和拉曼光。2.外部因素50温度：T低，φf增加。荧光素钠的乙醇溶液,T0℃时,每降低10℃,φ增加3%,-80℃时φ=100%.51溶剂的极性：电子激发态比基态的极性大，溶剂的极性增强，荧光强度增大，荧光波长红移。溶剂相对介电常数荧光峰l/nm荧光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率52pH值影响荧光强度示例NH3NH2NHOHHOHHpH值：27～1213存在形式：离子分子离子有无荧光：无蓝色荧光无0201018NHHCNHHCOHCOHHC3562565656光强度相对荧：－53熄灭剂：卤素离子、重金属离子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleighscatteringlight)：光子与分子发生弹性碰撞时，仅改变光子运动方向，不发生能量交换，这种散射光称为瑞利光。特点：波长与入射光相同。54拉曼光(Ramanscatteringlight)：光子与物质分子发生非弹性碰撞时，不仅改变光子运动方向，而且发生能量交换，这种散射光称为拉曼光。特点：当光子失去部分能量时，波长比入