色谱法概述

色谱法概述主要内容1234色谱法的分类色谱法的发展色谱法的起源色谱法的定义、特点色谱法的基本原理56色谱术语研究植物叶子的组成时，他将植物色素的石油醚浸取液通过填充有碳酸钙的直立玻璃管，再用纯净的石油醚自上而下淋洗，随着淋洗的进行，发现不同色素向下移动的速度不同，最后色素中各组分互相分离，形成不同颜色的谱带。一、色谱法的起源1906年由俄国植物学家Tswett创立色谱柱流动相固定相石油醚色谱原型装置玻璃管碳酸钙谱带二、色谱法的发展色谱方法的发展色谱理论的发展1.色谱方法的发展1968年前后高效液相色谱法1975年离子色谱法80年代初超临界流体色谱法80年代中后期毛细管电泳法90年代后期毛细管电色谱法目前胶囊色谱、手性分离色谱、高分辨色谱、多维色谱1935年离子交换柱色谱法1941年液液分配柱色谱法1944年纸色谱法1952年气相色谱法1956年薄层色谱法1959年凝胶柱色谱法2.色谱理论的发展在各种色谱方法建立的同时，色谱理论也逐步发展和成熟起来。主要有:塔板理论速率理论气相色谱发展初期，Martin等人借助分馏中的塔板概念，把色谱柱设想为由许多塔板组成的分馏塔，把色谱分离过程比拟作分馏过程，提出了表达柱效能模式的塔板理论。012345LH色谱柱ΔV（1）塔板理论L:色谱柱柱长;H:理论塔板高度;ΔV：样品体积气相色谱兴起之后，科学家们在实际研究中发现得到的色谱峰往往是展宽的图形，塔板理论无法解释这种现象。为此，荷兰学者VanDeemter等人于1956年提出了速率理论。该理论吸收了塔板理论中理论塔板高度的概念，并同时考虑影响理论塔板高度的动力学因素（涡流扩散、分子扩散、传质阻力、载气流速等），研究色谱分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响，对色谱分离条件的选择具有指导意义。速率理论为气相色谱法的实践提供了理论指导，同时为高效液相色谱法的创建提供了启迪和依据。（2）速率理论气相色谱高效液相色谱高效凝胶色谱毛细管电泳经过一个世纪的发展，色谱法无论是在理论上、方法上、设备上及文献资料上都已经成熟了；已被广泛应用于医药卫生、食品、环境、材料、化工、农业及生命科学等各个领域，成为分离分析多组分混合物的极为重要的研究手段。色谱法（Chromatography）又叫色层法或层析法，是一种分离分析技术，是分离分析多组分混合物质的极有效的物理及物理化学分析方法；是以试样中各组分与固定相和流动相之间的相互作用力（如吸附、分配、离子交换、排阻、亲和等作用力）的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。三、色谱法的定义、特点1、色谱法的定义•固定不动的一相，称为固定相，可以是固体或液体。•携带试样混合物流过固定相的流体称为流动相，可以是气体、液体或超临界流体。•内有固定相，用以分离混合物的柱管称为色谱柱。几个概念气相毛细管柱液相柱凝胶色谱柱2、色谱法的特点分离效率高分析速度快灵敏度高样品用量少选择性好多组分同时分析分离和测定同时完成应用广泛易于自动化四、色谱法的分类按流动相和固定相的状态分类按固定相的操作方式分类按色谱过程的分离机制分类从色谱法的发展知，各种类型的色谱法很多，可从不同的角度对其进行分类。主要有以下三种：1、按流动相和固定相的状态分类随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱法(4)流动相固定相类型液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱液相色谱LC气相色谱GC(1)(2)(3)SFC超临界流体色谱超临界流体2、按固定相的操作形式分类柱色谱平面色谱固定相装在管柱内固定相呈平面状填充柱色谱毛细管柱色谱按照管柱的粗细和固定相的填充方式高分子薄膜色谱薄层色谱纸色谱按平面材料的不同柱色谱法：将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。纸色谱法：利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。以吸附水分的滤纸作固定相薄层色谱法：将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。以涂敷在玻璃板上的吸附剂作固定相3、按色谱过程的分离机制分类吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法尺寸排阻色谱法亲和色谱法生物色谱法（1）吸附色谱法：用固体吸附剂作固定相，根据样品中不同组分在吸附剂上的物理吸附性能的差异进行分离。如气固色谱法、液固色谱法。（2）分配色谱法：用液体做固定相，根据不同组分在固定相（液体）和流动相之间分配系数的不同进行分离。如气液色谱法、液液色谱法。（3）离子交换色谱法：固定相是离子交换剂，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别进行分离。（4）尺寸排阻色谱法：又叫凝胶色谱法或空间排阻色谱法，用多孔性凝胶作固定相，根据不同大小的组分分子在多孔性凝胶中的选择性渗透进行分离。（5）亲和色谱法：以在不同基体上键合多种不同特征的配体作固定相（称固定化分子），根据不同组分与固定相的高专属性亲和力进行分离。（6）生物色谱法：采用各种具有生物活性的材料（例如：酶、载体蛋白、细胞膜、活细胞等）作固定相，利用固定相与各种生物活性物质的选择性结合进行分离。色谱法的简单分类色谱法气相色谱法液相色谱法超临界流体色谱法填充柱色谱法毛细管柱色谱法平面色谱法柱色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法薄层色谱法纸色谱法高分子薄膜色谱法色谱过程色谱图五、色谱法的基本原理在色谱分离过程中，当流动相携带试样对固定相做相对运动时，由于试样中各组分在固定相和流动相之间的作用力（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻力和其他亲和力等）存在微小差别，使得不同组分被流动相运载移动的速率不同，产生差速迁移，使得结构和性质有微小差别的不同组分按先后次序从固定相中流出而分离开来。差速迁移是色谱分离的基础。下面以吸附柱色谱法为例来学习色谱分离的过程和原理。3.固定相1.试样2.流动相………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….….………4.色谱柱图17-1色谱分离过程示意图组分A比组分B先从色谱柱中流出，原因是什么？组分A和B结构和性质的不同导致它们与固定相的作用力不同组分A与固定相的吸附作用力弱，随流动相迁移的速率快，先流出色谱柱；组分B与固定相的吸附作用力强，随流动相迁移的速率慢，后流出色谱柱。色谱分离过程在吸附柱色谱法中，固定相是固体吸附剂，吸附剂对不同的组分表现出程度不同的吸附能力。待分离的组分随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同组分有不同的吸附力，使得不同组分随流动相迁移运载的速率不同，产生差速迁移，最后使得不同组分按先后次序流出色谱柱，实现分离。吸附解吸附再吸附再解吸附反复多次吸附-解吸附分离差速迁移吸附能力弱的组分先流出，吸附能力强的组分后流出。各组分在结构和性质上的差异微小差异积累较大差异作用力的差异在吸附柱色谱法的整个分离过程中，始终贯穿着吸附剂对被分离组分的吸附与解吸附作用。吸附剂对不同的组分有不同的吸附能力，使得各组分在吸附剂上滞留的时间不同，随流动相运动的速率不同而分离开来。分离过程是一个吸附-解吸附（脱附）的平衡过程。根据吸附柱色谱法的分离过程和原理可以推断其他各种类型的色谱方法的分离过程和原理。色谱分离过程的本质是待分离的组分在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同组分在两相之间的分配不同，使得各组分随流动相迁移的速度不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。简言之，色谱分离过程就是试样中的各组分在色谱柱内两相（固定相和流动相）间进行多次“分配”的过程。由吸附柱色谱法知：色谱法利用不同组分在不同相态（固定相和流动相）中的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱法的基本原理是基于混合物中的各组分在固定相和流动相之间的作用力差异、平衡分配的差异。综上所述，色谱法是利用混合物中各组分在两相（固定相和流动相）中吸附、分配、离子交换、亲和力、分子尺寸等的差异，使固定相对各组分的保留作用不同，产生差速迁移而进行分离的方法。六、色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线和色谱峰基线峰高保留值区域宽度分配系数分配比分离度试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度的变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。流出曲线：色谱仪记录器记录的电信号强度对t作图所绘制的曲线。色谱峰：曲线上突出的部分。基线：色谱柱中仅有流动相通过时，检测器响应的信号记录，通常与横轴平行。基线反应检测器的噪音随时间的变化，稳定的基线应当是一条直线。色谱峰基线峰高（h）：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。峰面积（A）：色谱峰所包围的面积。色谱峰区域宽度：描述色谱流出曲线的另一个重要参数，用来量度色谱分离的效率，反映柱效的高低。区域宽度的三表示形式标准偏差σ：0.607倍峰高处色谱峰宽的一半半峰宽W1/2：峰高一半处对应的峰宽峰底宽度W：峰两侧拐点上切线在基线上的截距三者关系：W=4σ=1.699W1/2保留值死时间保留时间调整保留时间死体积保留体积调整保留体积相对保留值tV保留时间tR：组分通过色谱柱所需的时间死时间t0：不被保留的组分从进样到色谱峰最大值出现的时间调整保留时间tRˊ：扣除死时间后的保留时间tRˊ＝tR－t0死体积VM：指惰性组分从进样开始到柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积；指从进样器到柱后出口未被固定相所占据的一切空间。可由死时间与流动相流速Fc(mL/min)计算：VM=tM·Fc保留体积：从进样至被测组分出现最大浓度时流动相通过的体积，VR。调整保留体积VR’：某组分的保留体积扣除死体积，称为该组分的调整保留体积。相对保留值γi.s：某组分的调整保留值与另一基准物的调整保留值之比。注意：相对保留值不是两个组分保留时间或保留体积之比；而是调整保留时间或调整保留体积之比。分配系数（partionfactor）K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：MsccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K分配比（partionradio）k在实际工作中，