噬菌体展示技术20..

theleaderinenzymetechnologyNEBNEB完美品质完美品质成就科学梦想成就科学梦想报告人：杨毅MDPhDEmail:[e-mail]nology噬菌体展示系统噬菌体展示系统PhageondisplayPhageondisplayExponentialgrowthinpublicationsreferringtophagedisplay.ThenumberofMedlinecitationscontainingtheterms‘phage’and‘display’areplottedagainsttheyearofpublication.TIBTECHNOVEMBER1999(VOL17).OfNeedlesandHaystackstheleaderinenzymetechnology噬菌体展示系统噬菌体展示系统PhageondisplayPhageondisplay•噬菌体展示原理–噬菌体展示定义、分类–简介噬菌体及淘选过程•噬菌体展示应用•商业化噬菌体展示系统theleaderinenzymetechnology表型表型————基因型基因型展示肽展示肽————编码基因编码基因什么是噬菌体展示什么是噬菌体展示　　是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNADNA则位于病毒粒子内。　　使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。theleaderinenzymetechnologySmithGP.Science1985;228:1315-7SmithSmith在在19851985年首次证实外源年首次证实外源DNADNA可以插入丝状噬可以插入丝状噬菌体基因菌体基因IIIIII中，并与中，并与pIIIpIII蛋白融合展示。蛋白融合展示。噬菌体展示技术噬菌体展示技术theleaderinenzymetechnology展示系统　展示系统　DisplaySystemCellBasedCellFreePhageDisplayCellSurfaceDisplayRibosomeDisplaymRNADisplaytheleaderinenzymetechnology噬菌体展示系统的分类噬菌体展示系统的分类ClassificationofphagedisplaysystemsTruePhagePhagemid根据载体不同Vector根据载体不同VectorM13,f1,fdT7,T4,lamda根据噬菌体不同Phage根据噬菌体不同PhageSchematicrepresentationofT7PhageSchematicrepresentationofM13Phage随机肽库cDNA文库根据文库不同Library根据文库不同Library抗体文库蛋白质文库theleaderinenzymetechnology¾丝状噬菌体：M13、f1和fd。¾单链DNA病毒,6407bp。¾基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。¾与展示密切相关的有两种结构蛋白质。¾DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒。M13M13噬菌体的组成和结构噬菌体的组成和结构StructureofM13filamentousphageSchematicrepresentationofM13PhagetheleaderinenzymetechnologyLifeCycleofM13LifeCycleofM13¾pIII蛋白结合于E.Coli的F纤毛;¾细菌的Tol蛋白复合体解聚噬菌体的衣壳蛋白，转运至胞浆（再用）;¾病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA；¾以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。¾第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37oC）。¾感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。theleaderinenzymetechnology次要衣壳蛋白次要衣壳蛋白pIIIpIIIBRIEFINGSINFUNCTIONALGENOMICSANDPROTEOMICS.VOL1.NO2.189–203.JULY2002¾406aa组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。¾由三个功能区组成：¾¾N1N1穿膜区：穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。¾¾N2N2受体结合受体结合区：区：负责结合F菌毛。¾¾CTCT疏水区：疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关。¾¾G1G1、、G2:G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性。InfectionofE.colibyFfbaceriophagetheleaderinenzymetechnology主要衣壳蛋白主要衣壳蛋白pVIIIpVIII¾每个病毒子含约2700个拷贝，约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。¾以pIII融合子方式表达的多肽是低价的，而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子~200个拷贝）。¾这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。¾所有Ph.D.文库都是pIII融合方式（每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽）。theleaderinenzymetechnologyTypesofphagedisplayTypesofphagedisplaysystemsystemSmithetal.(1997)Chem.Rev.97,391-410phagemidvectorspVIII展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。pIII只要不影响感染，可以展示300aa的多肽。噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86kDa。theleaderinenzymetechnology噬菌体质粒－噬菌体质粒－方便克隆、增强遗传稳定性Phagedisplaywithphagemidvectors噬菌体质粒特征：噬菌体质粒特征：9携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因，没有其他噬菌体基因。9有质粒复制起点(322ori)和噬菌体复制起点(f1ori－用于合成ssDNA)。9有包装序列信号（packingsignal）。9有供筛选的抗生素标记基因。HelperphageHelperphage：：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（f1oridefect)。包装后的噬菌体包含有两种不同来源的成份：噬菌体质粒和Helperphage。theleaderinenzymetechnology多价展示？单价展示？多价展示？单价展示？PolyvalentorPolyvalentormonovalentmonovalentdisplay?display?展示价位（Displayvalency)：噬菌体表面展示的多肽的拷贝数。展示价位不同所筛选的分子亲和力就会不同。用噬菌体质粒时，以pIII展示为例：10%病毒展示为单价，非常少量的展示为两个拷贝，绝大多数只展示野生型pIII。Themajordisplayingspeciesismonovalent,butmostparticlesdonotdisplayatall.theleaderinenzymetechnologyTruephageTruephagePhagemidPhagemid多价展示单价展示筛选到的分子亲和力相对低亲和力高极少或无未展示的噬菌体大部分是未展示的噬菌体*高拷贝数增加了抗原性可能会影响噬菌体的组装和增殖易克隆，遗传稳定性好theleaderinenzymetechnology改进改进helperphagehelperphagetheleaderinenzymetechnology•pJuFo噬菌质粒中加入了JunandFosLeuZipper基因•两个基因都以PelB作为signalsequence，以lac作为promoter/operator。•NH2-pelB+JunLeuzipper+C-terminaldomainpIII-COOH•NH2-pelB+FosLeuzipper+cDNA-product–COOH•Jun和Fos通过二硫键形成异源二聚体展示展示cDNAcDNA文库　文库　SelectionfromSelectionfromcDNAcDNAlibrarieslibrariesCarmerietal.Gene1993theleaderinenzymetechnology淘选　淘选　Findingtheneedleinthehaystack:ScreeningFindingtheneedleinthehaystack:Screening　　phagedisplaylibrariesphagedisplaylibraries建立噬菌体展示库淘选噬菌体展示库分析克隆theleaderinenzymetechnology淘选的方法－亲和淘选淘选的方法－亲和淘选••液相法：液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包被的表面。••直接包被法淘选法：直接包被法淘选法：••优点：优点：简单直接。••缺点：缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入•可能是由于分子的立体封阻•或者是靶分子表面的部分变性而引起theleaderinenzymetechnology噬菌体肽库与靶分子相互作用洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体将特异性结合的噬菌体洗脱下来三轮淘选后，克隆测序噬菌体肽库淘选示意图：噬菌体肽库淘选示意图：亲和筛选亲和筛选theleaderinenzymetechnology测定抗测定抗FLAGM2FLAGM2单克隆抗体的单克隆抗体的抗原决定簇抗原决定簇对每轮淘选所得到的克隆测序，结果清晰地显示核心抗原决定簇是DYKXXD,其中X可以是任意氨基酸。为了确定FLAG抗原决定簇序列DYKDDDDK中哪一个氨基酸是抗体结合所必需的，将单克隆抗体包被于96孔板，对Ph.D.-7展示文库进行三轮淘选。theleaderinenzymetechnology噬菌体展示系统噬菌体展示系统PhageondisplayPhageondisplay•噬菌体展示原理•噬菌体展示应用•商业化噬菌体展示系统theleaderinenzymetechnology噬菌体展示的应用噬菌体展示的应用•抗原表位分析•制备特异性抗体•制备疫苗、多价疫苗•构建新型的生物催化剂如Renetal(1997)将T4DNA连接酶展示于T4噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合体。或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造superenzyme。theleaderinenzymetechnology噬菌体展示的应用噬菌体展示的应用筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis从肽库中筛选到非竞争性地抑制FVIIa活性的肽段。CoagulationCascade.AcurrentsimplifiedviewofthecoagulationcascadeinitiatedbytheTF•FVIIacomplexisshown.theleaderinenzymetechnology噬菌体展示的应用噬菌体展示的应用蛋白质－蛋白质相互作用噬菌体cDNA文库与芯片相结合(a)合成噬菌体cDNA文库。(b)生物淘选。(c)铺板，挑克隆入微孔板，为制备芯片做准备。GeneralselectionschemeforcDNAexpression-productsdisplayedonphagesurface.Konthuretal2003TARGE