阿尔新蓝染色

阿尔新蓝、阿尔新蓝-茜素红染色1、阿尔新蓝染液100%乙醇80ml冰醋酸20mlalcianblue8GX0.1g充分混匀溶解后，37°静置过夜。2、无酸双染色剂（阿尔新蓝—茜素红S）A液：alcianblue8GX用于软骨染色。首先将阿尔新蓝粉末溶解到50%的乙醇中，37°孵育并摇匀，溶解后再加入95%乙醇是浓度达到70%。100mlA液=5ml0.4%阿尔新蓝+70ml95%乙醇+5ml1MMgCl2+20mldH2O。B液：0.5%alizarinredS,0.5galizarinredS粉末溶解于100ml蒸馏水中。混合液中试剂终浓度：0.02%alcianblue，40-60mMMgCl2,70%乙醇。在使用前，取10ul的B液和1ml的A液混合使用（现配现用）。3、斑马鱼整体软骨-骨骼无酸双染色取各处理组幼鱼，分装于1.5ml离心管中，每管约50只幼鱼。1）幼鱼组织固定麻醉幼鱼，使用4%的中性甲醛缓冲液（由PBS配制）或使用2%PFA固定在1.5ml离心管中，室温振荡10min，放置2h。吸走固定液，并用PBS清洗2次，使用50%乙醇脱水。2）染色去除50%乙醇，加入1ml阿尔新蓝-茜素红S染色液到离心管中，质问轻微振荡过夜。3）漂白漂白以去掉幼鱼表面色素。漂白液现配现用，由等量的3%H2O2和2%KOH混合组成，终浓度为1.5%H2O2和1%KOH溶液。染色管中，在去掉染色液后，加入1ml水，倒置混合吸去液体。再新加入1ml漂白液，并将离心管盖打开，室温放置20min。4）清理去掉漂白液，加入20%甘油/0.25KOH室温振荡30min至10h，边振荡边观察胚胎清理状态。然后用50%甘油/0.25%KOH替换之前的清理液，并再次室温振荡2h，放置过夜，显微镜下观察。5）保存和统计拍照染色后幼鱼可在50%甘油/0.1%KOH溶液中4°长期保存备用。并在此保存液中利用解剖镜和成像系统拍照。4、阿尔新蓝软骨染色1）幼鱼组织固定麻醉幼鱼，使用1.5ml离心管，固定在静置了两天的4%PFA溶液中，室温过夜。2）阿尔新蓝染色吸去PFA后，用95%乙醇溶液洗胚胎2次，彻底吸干后，添加1ml80%乙醇/20%冰醋酸配制的0.1%的阿尔新蓝溶液，取上清染液，染色过夜。3）洗脱用60%乙醇/40%PBS溶液冲洗胚胎1次后，换成40%乙醇/60%PBS再冲洗1次，再更换成20%乙醇/80%PBS冲洗一次，最后用PBS缓冲液冲洗2次。4）清理吸干PBS溶液后，使用溶解于饱和四硼酸钠溶液中的0.05%trypsin清理胚胎1-3h。5）漂白吸去胚胎周围的清理液并用PBS冲洗1次，然后添加1%KOH/3%H2O2溶液侵泡2-4小时。打开离心管盖30°左右静置，并观察胚胎的清理状态。6）脱色过1%KOH/3#H2O2：甘油梯度溶液。现用1:3比例，再换成1:1，最后换成3:1（1%KOH/3#H2O2：甘油）7）保存与拍照样品保存在50%甘油/50%PBS溶液中或保存在70%甘油中，在此保存液中利用解剖镜和成像系统拍照并统计。