植物离体繁殖

第五章植物离体繁殖2006-4-3植物离体繁殖(Propagationinvitro)植物快繁或微繁（Micropropagation）指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其在短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。是工厂化育苗的技术基础。植物快繁与传统营养繁殖相比的优点：繁殖效率高。生长速度快；培养条件可控制性强；占用空间小；管理方便，利于自动化控制；便于种质交换和保存。第一节植物快繁的器官形成方式植物快繁的器官再生主要分为五种类型：–短枝发生型–丛生芽发生型–不定芽发生型–胚状体发生型–原球茎发生型一、短枝发生型类似于微型扦插，指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。能一次成苗，遗传稳定，成活率高，但繁殖系数低。二、丛生芽发生型是大多数植物快繁的主要方式。指外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境（含有外源细胞分裂素）中不断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。不经过愈伤阶段，后代变异小，应用普遍，也可用于无病毒苗的生产。三、不定芽发生型指外植体在适宜培养基和培养条件下，形成不定芽，后经生根培养，获得完整植株的繁殖方法。分为通过愈伤组织产生不定芽，和直接产生不定芽两种方式。外植体涉及多种器官，如茎段、叶、根、花器官等。是植物快繁的另一种主要方式，繁殖系数高。但变异率较高，尤其是通过愈伤途径产生的植株。ABEC花烛叶片离体培养及植株再生四、胚状体发生型指外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞产生体细胞胚，从而形成小植株的繁殖方法。分为间接途径（经愈伤途径）和直接途径两种。成苗数量大、速度快、结构完整。但由于对其发生及发育过程了解不够，应用上还没有前两种广泛。DirectsomaticembryogenesisinBrassicanapus菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察针叶松体细胞胚及体胚萌发生长五、原球茎发生型是兰科植物特有的一种快繁方式。指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎的繁殖类型。原球茎可以增殖形成原球茎丛。大花蕙兰原球茎增殖与植株再生第二节植物快繁的程序植物快繁的程序包括四个阶段：–无菌（或初代）培养的建立–繁殖体增殖–芽苗生根–小植株的移栽驯化Ⅰ：无菌（或初代）培养的建立母株和外植体的选取：母株性状稳定、健壮、无病虫害污染。无菌培养物的获得外植体的启动生长：愈伤产生、不定芽发生或外植体芽直接生长。通过需要4-6周。Ⅱ：繁殖体增殖培养材料的增殖。主要增殖方式为诱导丛生芽或不定芽产生，再以芽繁殖芽的方式增殖，兰科植物为原球茎增殖途径。4-8周继代一次。一个芽苗增殖数量一般为5-25个或更多，多次继代可大量繁殖。增殖培养基：适当提高细胞分裂素和矿质浓度增殖体的大小和切割方法Ⅲ：芽苗生根离体生根：也称试管内生根。降低无机盐浓度，减少或去除细胞分裂素，增加生长素浓度。活体生根：也称试管外生根。通常芽苗可先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养5-10天，然后移到基质中生根。生根培养时间一般为2-4周。Ⅳ：小植株的移栽驯化移栽：洗去根部的培养基，将小植株移栽入培养基质中。驯化管理：移栽初期要保证空气湿度，减少叶面蒸腾；弱光照。同时，逐渐降低空气湿度，使其适应自然环境条件；增加光照强度。另外注意防止病害的发生。第三节影响植物快繁的因素植物快繁的目的是以尽可能高的效率生产试管苗，获得最大的经济效益。因此，在快繁时应使各种影响因素处于最适合快繁的状态。主要影响因素：外植体培养基培养条件继代培养移栽一、外植体：外植体的来源：最适的为茎尖、带芽茎段，也可以利用叶片、子叶、根段、花器官组织等。外植体生理年龄：幼嫩组织分化能力更强。外植体大小：不能太小，否则影响成活率。除非是用于脱毒苗的生产。二、培养基：基本培养基：MS培养基应用最为广泛。对于某些植物及生根阶段，以1/4或1/2MS较好。蔗糖和葡萄糖浓度为2-4%。生根时稍低。植物生长调节剂：主要以细胞分裂素和生长素的配合使用，调节外植体的生长和分化。另外ABA、GA、CCC等也具有不同的作用。培养基的物理特性：以固体培养较为普遍，也有采用液体培养，如兰花原球茎的增殖。三、培养条件：光照：1000-3000lx，阶段Ⅲ可增强。14-16h/天。温度：与植物的原产地相应。一般为25±2℃。有时可进行高温或低温的预处理。湿度：要求环境相对湿度不能太低，一般在70-80%。气体：要求培养基及培养瓶通气良好，同时及时转接。液体培养要求振荡培养，促进氧化交换。四、继代培养：主要指对阶段Ⅱ增殖形成的芽丛、胚状体或原球茎等进行转接继代。继代间隔时间一般为20天左右。五、移栽：根系结构不完善的试管苗移栽后不易存活。要求根系结构完整，具根毛，再生根的吸收能力强。叶表皮组织不发达的试管苗也不易移栽存活。移栽要求打开瓶口驯化2-3天；或在瓶内添加一些生长延缓剂如PP333、CCC等培育壮苗。第四节植物快繁的商业化应用植物快繁的重要用途是进行植物的商业化生产。世界上快繁商业化开始于上个世纪美国的兰花工业。我国的香蕉快繁苗占全国组培苗的2/3。其次有甘蔗、兰花、马铃薯、甘薯等。一、商业化生产规模及工艺流程试管苗生产规模的确定商业化实验室的设计商业化生产的配套设施商业化生产的工艺流程二、商业化生产及效益分析试管苗增殖率的估算生产计划的制定和实施产品质量监控商业化生产效益分析三、降低商业化生产成本的措施提高劳动生产率减少设备投资，延长使用寿命降低消耗降低污染，提高繁殖率和成活率简化培养基园艺植物种苗工厂化生产兰科植物生产无菌苗快速繁殖无菌苗驯化四、商业化生产应注意的问题污染–污染的来源：培养基及器具、器皿污染；外植体灭菌不彻底；操作原因；环境原因等–污染的控制：灭菌彻底；操作正确；保持操作区环境清洁无菌。遗传稳定性–影响遗传稳定性的因素：基因型；继代次数；器官发生方式。–降低遗传变异的措施：选用合适的基因型；减少继代次数；采用合适的器官发生方式；减少生长调节剂的使用浓度。玻璃化：–生理失调症状，表现为叶片、嫩梢呈水浸透明或半透明状。叶片脆弱易碎，角质层发育不全，没有功能性气孔。器官分化能力低，生根难，移栽后不易成活。–玻璃化苗发生原因：琼脂和蔗糖浓度偏低；培养温度偏高；细胞分裂素浓度偏高；乙烯的影响；光照偏弱；培养基含量偏高等因素。–防止玻璃化苗发生的措施：提高培养基硬度；降低培养基水势；提高蔗糖含量；增加培养瓶气体交换，降低湿度；增加光照，降低温度等。褐化：–是由于培养材料中的酚类物质被氧化形成。–影响褐化发生的因素：植物种类和品种（如木本比草本更易褐化）；外植体年龄和取材料时间；外植体损伤程度；光温因素；培养基成分。–防止措施黄化思考题：1、植物快繁的器官发生类型有哪些？2、如何区分体细胞胚和不定芽？3、试述植物快繁的全过程及影响因素。4、植物离体繁殖商业化生产中应注意哪些问题？第五章植物胚胎培养植物胚胎培养（EmbryoCulture）：指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植物的技术。包括成熟胚培养、幼胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养、试管受精等类型。应用于育种及胚胎发育相关的基础研究。1904年Hanning最早成功培养萝卜和辣根的胚。第一节植物胚培养一、胚培养的类型–成熟胚培养：培养较为容易，只需提供简单的培养基即可。–幼胚培养：要求培养基成分相对复杂，以保证胚的正常发育成熟后形成植株。二、胚培养的应用–克服远缘杂交不亲和性：对早期杂种胚进行离体培养，可克服受精后的障碍，获得远缘杂种。–打破种子休眠，缩短育种周期–提高种子萌发率：特别是对于长期营养繁殖的植物形成的种子，因其生活力普遍较低。