一轮-基因工程

基因工程的别名操作环境操作对象操作水平结果实质DNA重组技术、转基因技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的新的生物类型或生物产品基因重组一、基因工程的概念优点：克服远缘杂交不亲和的障碍定向改造生物的遗传性状与杂交育种相比与诱变育种相比1．基因拼接的理论基础（从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组?）(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子都是规则的双螺旋结构。一、基因工程诞生的理论基础2．外源基因在受体内表达的理论基础(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。（遗传密码破译）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(6个,4、5、8个)（2）作用：（4）结果：形成两种末端黏性末端平末端1、限制酶——“分子手术刀”（小结）切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。磷酸二酯键大本考向对练（2）书写限制酶存在于原核生物中的作用是什么?思考原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?思考防御机制1.原核生物中不存在该酶的识别序列2.识别序列被修饰，让限制酶不能切割如在甲基化酶的作用下把甲基转移到碱基上•要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？提问要切两个切口，产生四个黏性末端。•如果把限制酶来切割的黏性末端能相连，那么这两种酶必须满足的条件是？这两种酶切割的片段会产生相同的黏性末端，•双酶切指用两种限制酶分别切割切割目的基因和载体，这样做的优点是？防止目的基因和载体的自身环化，并防止目的基因的反向连接，从而确保目的基因定向插入到特定位置2.“分子缝合针”————DNA连接酶(2)分类注意书写E.ColiDNA连接酶T4DNA连接酶想一想:DNA连接酶与DNA聚合酶功能的异同？(1)来源：(2)作用：(1)来源：(2)作用：(1)作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。大肠杆菌“缝合”黏性末端T4噬菌体“缝合”黏性末端和平末端DNA聚合酶DNA连接酶区别2相同点DNA连接酶与DNA聚合酶功能的异同将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上。形成磷酸二酯键以一条DNA链为模板。将两个双链DNA片段之间的切口连接起来。不需要模板。为什么要用载体？3.“分子运输车”—基因进入受体细胞的载体：1、无法复制（原因）2、无法表达（原因）3、目的基因是否进入到受体细胞需要借助于载体上的标记基因简单快速的检测出来。4、基因直接进入细胞的概率很低；作为载体必须具备哪些条件1）能够在受体细胞中复制，使目的基因稳定存在。2）具一至多个限制酶切点，以便外源基因插入。3）具有某些标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。•天然的DNA分子可以直接作为载体吗？为什么？•1、载体DNA必须具备自我复制能力•2、载体DNA必须具备一到多个合适的酶切位点供目的基因插入。•3、载体DNA必须带有标记基因。•4、载体DNA必须安全并大小合适。•实际上天然的DNA并不完全具备上述条件，都要进行人工改造。一.目的基因的获取1、目的基因主要是指____________________也可以是一些具有调控作用的因子。编码蛋白质的结构基因3、常用方法：人工合成法反转录法化学合成法利用PCR技术扩增从基因文库中获取2、获得途径从自然界已有物种中分离人工方法合成基因文库基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）基因文库？(1)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因组文库与cDNA文库的比较P10表文库类型基因组文库cDNA文库大小基因中是否有启动子基因中是否有内含子基因多少物种间的基因交流小大有无有无某种生物的全部基因某种生物的部分基因部分基因可以可以（2）利用PCR技术扩增目的基因1、定义：PCR——多聚酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。DNA复制2、原理：3、条件：4、过程：一段已知目的基因的核苷酸序列一对引物；模板DNA；dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；6、仪器：PCR扩增仪根据这一序列设计相应的引物为什么？PCR反应过程PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。引物与模板GC含量高（3）人工合成原理（2条？）反转录法：目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA逆转录酶DNA聚合酶双链DNA(cDNA)根据已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列推测推测目的基因化学合成3.基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因为什么不能将基因直接导入受体细胞？位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合位点。位于基因的尾端,终止转录。鉴别并筛选含有目的基因的受体细胞。2、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用三、将目的基因导入受体细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持____和_____的过程。转化:受体细胞稳定表达1、导入植物细胞:2、导入动物细胞:3、导入微生物细胞:常用方法：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射法感受态细胞法（或Ca2+转化法）1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体DNA上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌农杆菌的作用？3、将目的基因导入微生物细胞常用法：常用受体细胞：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA（用Ca2+处理，增加细菌细胞壁的通透性）感受态细胞法（或Ca2+转化法）为什么把大肠杆菌处理成感受态细胞？检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因1、导入检测目的：方法：DNA分子杂交技术过程：①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中四、目的基因的检测与鉴定从转基因生物中提取的基因组DNA探针：杂交的对象：用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段15N15N14N探针转基因生物的DNA变性变性14N2、转录检测目的：检测目的基因是否转录出了mRNA方法：分子杂交技术用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段探针：杂交的对象：从转基因生物中提取的mRNA.3、翻译检测目的：检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:抗原抗体杂交技术从转基因生物中提取的蛋白质抗原：抗体：将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体4、个体生物学水平的鉴定课本24用于基因治疗的基因种类①正常基因：从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变基因，或依靠其表达产物。②反义基因。即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA进行互补，来阻断非正常蛋白质的合成。③自杀基因：即编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因。(4)对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？______________________。原因是：________________________________。应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造首先，天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因也就是对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传下去。如果对蛋白质直接改造，一方面蛋白质空间结构复杂，改造困难，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子也无法遗传；其次，对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难度要小得多。①获取目的基因（例如血清白蛋白基因）②构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）③显微注射导入哺乳动物受精卵中④形成胚胎⑤将胚胎送入母体动物⑥发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达）。思考:用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器来生产人类血清白蛋白的操作过程是怎样的？乳腺生物反应器的优点：①产量高；②质量好；③成本低；④易提取。