RNAiso-plus

TakaraCode：D9108ARNAisoPlus（TotalRNA提取试剂）宝生物工程(大连)有限公司说明书目录内容页码●制品说明1●制品组成1●保存和运输1●RNA提取实验前的准备1●实验操作2●RNA提取操作流程图3●实验例4●Troubleshooting5●参考文献6注意事项本制品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会中毒、导致灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛时，应立即用大量的水冲洗以及前往医院治疗；接触到皮肤时，应立即用大量的聚乙二醇400（Polyethyleneglycol400）冲洗，严重时请前往医院治疗；使用本制品后感觉不舒服时请前往医院治疗。●制品说明RNAisoPlus是广谱型TotalRNA提取试剂。实验操作快速方便，颜色鲜明，便于分层。本制品可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取TotalRNA。样品在RNAisoPlus中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（鲜红色下层），RNA分布在上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到TotalRNA。RNAisoPlus具有以下特性：1.广谱性强。可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取TotalRNA。2.纯度俱佳。提取的TotalRNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。3.快速简便。实验操作快速方便，整个操作在一小时内便可完成。4.颜色鲜明。加入氯仿离心后，会形成无色的上清层和鲜红色的下层（有机层）。●制品组成RNAisoPlus*100ml*RNAisoPlus中含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。【试剂盒之外所需准备试剂】◆氯仿◆异丙醇◆75%乙醇（DEPC处理水配制）◆RNase-free水（制备方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.1%（v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌。）●保存和运输1.可以在室温下保存，建议在2-8℃下避光保存，效果更佳。2.可以在常温下运输。●RNA提取实验前的准备RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。（1）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。【试剂配制】用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟）或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。-1-●实验操作1.RNAisoPlus的使用量情况如下。样品量RNAisoPlus使用量（ml）10cm2的贴壁培养细胞1107的悬浮培养细胞1~2100µl的白细胞2100µl全血250～100mg的普通组织样品150～100mg的特殊组织样品（肝、脾、骨及软骨等）215～30mg的植物材料（多糖和多酚含量不高的）12.实验样品的研磨和匀浆。A.贴壁培养细胞①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。②每10cm2生长的培养细胞中加入1ml的RNAisoPlus，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞）。③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。④室温静置5分钟。B.悬浮培养细胞①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000g4℃离心2分钟，弃上清。②向每107个细胞中加入l~2ml的RNAisoPlus。③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。④室温静置5分钟。C.动物组织、植物材料样品①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。②对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAisoPlus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAisoPlus的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。③将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。④12,000g4℃离心5分钟。⑤小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。3.TotalRNA的提取。①向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAisoPlus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5分钟。②12,000g4℃离心15分钟。③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。④向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。⑤12,000g4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。-2-4.RNA沉淀的清洗。小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇lml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。5.RNA的溶解。室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。●RNA提取操作流程简图-3-适量的动植物组织或培养细胞室温静置5分钟加入1/5RNAisoPlus体积量的氯仿室温静置5分钟将上清液转移至新的离心管中室温静置10分钟向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀弃上清保留沉淀溶解于适量的DEPC处理水中加入适量的RNAisoPlus后匀浆振荡混匀12,000g4℃离心15分钟加入与上清液等体积的异丙醇12,000g4℃离心10分钟12,000g4℃离心5分钟干燥12,000g4℃离心5分钟，上清转移至新的1.5mltube中●实验例1.从动物组织中提取TotalRNA。使用本试剂盒从大鼠肝脏、心脏、脑、脾、肾、小肠、骨骼肌、胰腺等组织中提取了TotalRNA，电泳结果见图1。1%Agarose凝胶电泳图M1：DL2,000DNAMarker1：RatLiver2：RatHeart3：RatBrain4：RatSpleen5：RatKidney6：RatSmallIntestine7：RatSkeletal8：RatPancreas图1.动物组织RNA提取结果电泳图2.从植物组织中提取TotalRNA。使用本试剂盒从马铃薯块根、香菇子实体、烟草叶片、水稻叶片、芒果果实、花生果实等组织中提取了TotalRNA，电泳结果见图2。1%Agarose凝胶电泳图M1：DL2,000DNAMarker1：马铃薯块根2：香菇子实体3：烟草叶片4：水稻叶片5：芒果果实6：花生果实图2.植物组织RNA提取结果电泳图3.从全血中直接提取TotalRNA。从全血中提取RNA，通常需要分离白细胞，而使用1ml本试剂可以直接从100μl全血中提取TotalRNA，电泳结果见图3。1%Agarose凝胶电泳图M1：DL2,000DNAMarker1：-80℃保存的全血样品2：新鲜的全血样品图3.全血RNA提取结果电泳图-4-M112345678123456M1M1124.从培养细胞中提取TotalRNA。使用本试剂盒从HL-60细胞、HT293细胞、CHO-K1细胞、Hela细胞、香菇培养菌丝、酵母培养细胞、E.coliJM109细胞等培养细胞中提取了TotalRNA，电泳结果见图4。1%Agarose凝胶电泳图M1：DL2,000DNAMarker1：HL-60细胞2：HT293细胞3：CHO-K1细胞4：Hela细胞5：香菇培养菌丝6：酵母培养细胞7：E.coliJM109细胞图4.各种培养细胞RNA提取结果电泳图●Troubleshooting1.一般情况下的组织或细胞中所能提取的RNA量如下表：组织材料起始样品量TotalRNA提取量血1ml15～20μg白细胞1×107个约20～40μg肝脏1g约5,000μgHL-60培养细胞1×107个约100μg烟草叶片1g约1,000μg肾脏1g约3,000μg骨骼肌1g约1,500μg脑1g约1,500μg2.有关RNA的吸光度说明如下：260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.2之间，当R1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TEBuffer。3.如何计算RNA的浓度？RNA浓度=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04μg/μl。4.提取的RNA中含有多糖怎么办？大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去，使用此类组织材料提取RNA时，建议增加RNAisoPlus的使用量、采用LiCl沉淀的方法或按照下述方法进行：向裂解液中加入氯仿离心分层后，抽提水相中的RNA，向水相中加入0.25ml的异丙醇（每使用1mlRNAisoPlus），再加入0.25ml的盐溶液（0.8M柠檬酸钠，1.2M氯化钠）轻轻反复颠倒数次混匀。室温静置5分钟后，4℃12,000g离心10分钟（替代原来异丙醇沉淀，后续步骤相同）。但此方法会损失大量RNA，导致收量降低，smallRNA的损失尤其严重。-5-M112345675.一些富含多糖多酚的植物材料，按照上述方法仍无法有效提取出RNA，怎么办？可以搭配使用RNAiso-mateforPlantTissue（TakaraCode：D325）进行提取，如香蕉果实、松树针叶等特殊组织材料均可以使用这种方法有效地进行提取。若提取的结果仍不满意，可以使用RNAisoforPolysaccharide-richPlantTissue（TakaraCode：D326）提取。6.RNA提取量较低怎么办？①向组织材料中加入RNAisoPlus后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。②相分离后请尽量完全回收上清液。7.提取的RNA不溶怎么办？①75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。②可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。③RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，避免枪头接触蛋白层。④溶解液更换为0.5%的SDS溶液（DEPC处理水配制）。8.OD260/OD280值1.65，为什么？①RNA应使用TEBuffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。②样品裂解时加入的RN