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PCR实验室标准化管理与质量控制温州医学院检验医学院温州医学院附属第一医院检验科陶志华PCR实验室标准化管理第一部分一.PCR实验室的标准化管理依据：按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫检字[2002]8号1.PCR实验室的设置工作区组成(每区不同颜色隔离衣)试剂准备区、样本准备区、PCR扩增区、PCR产物分析区、标本接收及工作区组成其设备、仪器等物品专用2.PCR实验室设置的管理注意：唯一流向制度问题物品的专用与移动问题3.PCR实验室的人员配置相对固定的专业人员（学历与职称）培训与上岗证PCR检测干扰因素较多，结果分析复杂，其应用需要与临床充分沟通。PCR实验室工作人员应掌握相关学科知识及应用能力（实验技能、分析能力、沟通能力）4.仪器设备的管理(1)建档管理：a.仪器设备的一般情况b.仪器设备的相关文件c.仪器设备的损坏，故障，修理记录d.有问题的仪器设备停用标识e.仪器设备的报废处理(2)仪器设备的分区专用(3)仪器设备的校准和检定(4)进行定期的维护和保养5.实验材料的购买和管理(1)PCR检测试剂选用:经有关机构检定批准上市的商品化试剂盒，商品试剂三证齐全（生产许可证、产品注册证、经营许可证）。(2)Tip头选购：必须使用有滤蕊的PCR专用Tip头b.内包装检查：内包装是否有破损，泄漏，内容物是否齐全，是否有相应的使用说明书等。a.外包装检查：包装应完整无损无污，标识清楚:厂家名称，品名，批准文号，生产日期，有效期等。(3)试剂及耗材的验收：c.性能检查a.PCR检测试剂分区放置：核酸提取液，阴、阳性对照、定量标准及其它标本处理用试剂存于样品处理区；扩增反应体系试剂存于试剂配制区。b.PCR检验试剂存放于-20℃冰箱。c.无菌处理前的耗材存放于试剂准备区，根据日常工作量，定期定量处理后放至样品处理区和扩增区。(4)试剂及耗材的贮存：体系建立后，如有必要更换试剂品牌，实验室主任须向科技术负责人提交书面报告说明更改理由；经科技术委员会讨论，科技术负责人签字批准方可更换。(5)实验室不能随意更改检测体系6.PCR检测的标本管理(1)标本接收接收标本时应核对标本与检验申请单的一致性，对标本状态进行登记记录，并在登记本上签字。检验申请有不清晰情况时，应即时与临床科室或相关人员联系核实，并做好记录。(2)标本的唯一性标识标识由三部分构成-----检测项目、标本采集日期、该检测批次的标本序号，三部分间无间隔符号，例如：HBV020601a1（项目年月日序号）。标本的唯一性标识须字迹清晰明了，不得随意作任何涂改；必须时，在旧标识上划双线更改，更改后应保持旧标识可辨识(3)标本废弃处理废弃样本经确认后，保持容器完整，置于废弃标本处，经密闭收集，统一焚烧处理,并有记录。7.PCR试验记录的管理（1）记录方法a.接受标本记录：以书面形式记录病人信息、样本信息、是否保存，同时对样本作标识，记录人签名；检验时，将标识的样本带入样本处理间处理。b.PCR扩增检测记录：检测结果以清楚的唯一标识保存于PCR扩增仪的电脑的指定文件夹内，并定期进行备份与整理。c.保存的文件夹及文件标识号：d.电子保存的软件备份要求：每一个月进行一次电子报告的软件备份；安排在每月的最后一个工作日完成。(2)记录保存a.电子数据的保存:将病例资料、样品资料、检测结果录入报告系统，产生报告，同时保存记录，记录人签名b.书面记录的保存:书面记录（病例资料和结果记录）装订保存于报告系统旁的抽屉里，每月进行整理，所有记录保存两年，两年后交科室统一建档封存，封存记录的开启须经科主任同意并委派档案管理人在场。(3)记录的保密：a.“data”由系统设置密码保护；b.结果资料在报告系统设置密码保护；c.在用的及保存的文字记录须随时在实验室工作人员的监管下，脱离本室人员视线监管的须存放在上锁的抽屉或文件柜内，钥匙由该工作人员保管。d.记录不能涂改，需修改时可用红笔在修改内容上加双斜杠并在备注栏中说明、签字8.PCR检测结果的报告(1)报告的要求检测报告应准确、清晰、客观(2)报告的形式各医院自定(3)报告单的发放与管理（凭？取单）电话报告？(5)化验单需邮寄和E-mail形式发放的管理9.抱怨的内部处理(1)抱怨的接受：医生、病人、其他人执行者在接受抱怨时，应记录抱怨者姓名、地址、联系方式、抱怨内容（必要时首先稳定抱怨者情绪）。(2)抱怨的处理（投诉）a.能当时处理的抱怨及时解决，记录。b.不能当即答复的,按逐级授权,汇报解决。c.抱怨的处理以病人满意为目的，但必须以遵重科学，遵重事实为原则，在不违背科学原则，医疗行为规范的基础上，争取抱怨者最大程度的理解。10.传染性防护(1)来自所有病人的血液和体液都被认为是具有传染性。标本采集、运送过程中，应保持容器完好，无泄漏。(2)处理血液和体液的工作人员都应戴上手套，穿防护服，戴帽子、口罩。(3)在标本处理过程中，手或其它部位的皮肤在接触血液或其它体液后必须立即彻底清洗。临床基因扩增实验室质量控制第二部分为什么特别强调质量控制？？容易污染－假阳性处理不当－假阴性假阳性问题：标本、试剂及实验场地的污染试剂盒的质量问题UNG酶是一种选择，但不可因此而高枕无忧加强管理最为重要选择优质试剂盒假阴性的问题：原因：1.标本处理等操作过程问题2.标本中存在抑制剂3.由于基因突变所致解决的办法：1.稀释标本2.点突变的检测3.结合其他方法分析4.加强与临床联系与对话临床基因扩增实验室质量控制为什么强调质量控制？目前国内所用核酸定量监测方法，受模板浓度、PCR反应体系的批间差异影响较大。因此，必须进行方法学的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以此来规范PCR实验室的室内质控工作室间质量控制室内质量控制临床基因扩增检验的室内质量控制测定前的质量控制操作实验过程质量控制质量控制统计学处理测定前质量控制标本采集和留取实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法人员培训操作实验过程质量控制标本核酸提取质量控制靶核酸提取的质量和效率临床标本及核酸提取中可能存在的抑制物和干扰物质扩增和产物检测质控质控管设计已知弱阳性样本质控已知阴性样本质控试剂空白质控已知弱阳性样本质控监测整个实验过程有效性阴性血清样本质控监测实验室的以前扩增产物的污染；由实验操作所致的标本间的交叉污染；扩增反应试剂的污染。试剂空白管质控监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性。监测反应液加样区及加样过程是否发生污染。如想鉴别实验室是否发生污染，可将一个或多个空管打开静置于标本制备区30～60分钟，然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性，则说明实验室以前扩增产物的存在。统计质控方法Levey-Jennings质控图方法Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法高、低值质控血清的制备将常规检测的血清标本按高、低值分类后进行混合分装（每管一个检测单位），冻存于-20℃冰箱备用。购买检测结果质量监控按常规方法每天插入一份高、低值质控血清和阴性质控血清进行定量检测（包括标本预处理、DNA提取等步骤）连续20天后分别计算出高、低值血清的均值（x）、标准差（s）和变异系数（CV）制作L-J动态质控图高值质控血清以强阳性血清为宜低值质控血清以临界值血清为宜结果-3.00-2.00-1.000.001.002.003.00051015202530次数均值-3.00-2.00-1.000.001.002.003.00051015202530次数均值结果标准曲线的截距和斜率质控以标准曲线斜率做质控图以标准曲线截距做质控图用同批号试剂同批号标准品连续检测20个批次试剂a标记探针荧光强度及背景荧光试剂b标记探针荧光强度及背景荧光试剂c标记探针荧光强度及背景荧光试剂a质量结果我们选择试剂盒a用于常规HBVDNA荧光定量检测，并用该试剂盒标准曲线的斜率与截距对试剂批间差异实施质量监控，其结果见图2和图3。标准曲线斜率与截距的批间差同批号试剂批间不同批号试剂批间斜率截距斜率截距均值3.72445.8083.67144.474标准差0.1160.7850.0450.952变异系数3.1061.7141.2292.140试剂a质量稳定性同批号试剂标准曲线斜率与截距的批间变异（即试剂盒批内）为3.106%和1.714%。不同批号试剂标准曲线斜率与截距的均值、标准差分别为3.671、0.045和44.474、0.952，其批间变异（既试剂盒批间）为1.229%和2.14%。HBVDNA定量PCR标准曲线斜率质控图HBVDNA定量PCR标准曲线截距质控图优点采用试剂盒标准曲线的斜率与截距以及荧光背景的噪音和荧光曲线的陡度对其实施动态质量监控，具有简捷、实用等优点利用试剂盒标准曲线斜率与截距对定量PCR进行室内质控，可有效控制因试剂分装质量(反应液/酶加入量)及酶活性而引发的失控四.临床PCR试剂盒的选用PCR或RT-PCR试剂盒的组成PCR试剂盒的分类影响PCR试剂盒质量的因素PCR试剂盒质量指标PCR试剂盒的选用原则1、PCR或RT-PCR试剂盒的组成核酸提取试剂标准品与质控品核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）2、PCR试剂盒的分类定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交、荧光PCR（分子信标和TaqMan等）定量测定：荧光定量PCR、PCR-ELISA定量等。3、影响PCR试剂盒质量的因素内在因素:原材料、核酸提取方法、方法学设计外在因素：试剂盒的运输和贮存试剂盒的运输和贮存PCR试剂盒在适当的贮存温度下的有效期一般为6个月核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20℃产物检测部分试剂则贮存于2～8℃。4、PCR试剂盒质量指标：1、灵敏度2、特异性3、重复性4、符合性5、产物检测反应本底6、抗污染能力7、操作简便性5、PCR试剂盒的选用原则参考试剂生产厂家的信息广告参考同行对有关试剂盒的使用效果参考有关机构的综合评价根据使用目的根据所在实验室的技术特点医院和患者的承受能力（收费）