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Parp-1基因Lys940Arg、Phe54Leu多态性及HP感染与胃癌发病风险的关联研究单勇1李玉民2李汛3周文策3石斌3何明彦3朱克祥3何建宏3【摘要】目的探讨PARP-1基因Lys940Arg、Phe54Leu多态性与胃癌高发区甘肃河西地区汉族人群胃癌发病风险的关系,并探讨基因多态性与HP感染等环境因素的相互关系。方法选择140名胃癌患者与125名健康人群，采用TaqMan实时荧光定量PCR方法分析PARP-1Lys940Arg、Phe54Leu基因多态性，采用Warthin-Starry法(W-S法)检测Hp感染。结果Lys940ArgAA、GA和GG基因型频率在病例组和对照组中分别为80.0%、16.4%、3.6%和90.4%、8.8%、0.8%；G等位基因频率分别为12.1%和5.6%。Phe54LeuCC、GC和GG基因型频率在病例组和对照组中分别为90.0%、8.6%、1.4%和92.8%、6.4%、0.8%；G等位基因频率分别为5.7%和4.0%。PARP-1Lys940ArgG基因型携带者患胃癌的风险是AA基因型携带者的2.4倍(OR=2.354,95%CI1.140-4.861,P=0.018)，并使Hp感染后胃癌发生的危险性增加6.6倍(OR=6.600,95%CI1.883-23.135,P0.05)，使有胃癌家族史者胃癌发病风险增加6.7倍(OR=6.700,95%CI1.257-35.722,P0.05)。Phe54Leu与Lys940Arg各基因型分布频率相似，其基因多态与胃癌易感性无关，但G基因型与Hp感染有协同作用，使胃癌发病风险增加5.3倍(OR=5.346,95%CI1.177-24.292,P0.05)。结论PARP-1基因Lys940Arg多态可能与甘肃河西地区汉族人群胃癌易感性有关，Phe54Leu多态与胃癌发病风险无相关，但其与Lys940Arg位点可能存在一定的连锁不平衡关系，并可放大940G基因型的致病风险。【关键词】胃癌；PARP-1；多态性；易感性TherelationshipbetweenPARP-1geneLys940ArgandPhe54LeupolymorphismsandsusceptibilitytogastriccancerassociatedwithHPinfectioninHanChinesepopulationShanYong,LiYumin,LiXun,ZhouWence,ShiBin,HeMingyan,ZhuKexiang,HeJianhongDepartmentofGeneralSugery，FirstHospitalofLanzhouUniversity，Lanzhou730000，China【Abstract】ObjectiveToinvestigatetherelationshipofPARP-1Lys940ArgandPhe54LeupolymorphismsandsusceptibilitytogastriccancerassociatedwithHPinfectioninhexiarea，Gansuprovince．MethodsThepolymorphismsofPARP-1geneweredetectedbyrealtime-PCRin140patientswithgastriccancer(GC)and125healthycontrols;HPinfectionwasdetectedbyWarthin-Starry¡method．ResultsTheAA,GAandGGgenotypefrequenciesofLys940Argwere80.0%,16.4%,3.6%inGCcasesand90.4%,8.8%,0.8%incontrols,respectively.TheGallelefrequencyofLys940ArgamongGCcases(12.1%)washigherthanthat(5.6%)amongcontrols.TheGgenotypehadamorethan2.4-foldincreasedriskofgastriccancer(OR=2.354,95%CI1.140-4.861,P=0.018)．AsignificantlyhigherriskofgastriccancerwasalsoseenincaseswithLys940ArgGgenotypeandH.pyloriinfectorandpositivefamilyhistorythanincontrols(OR:6.600and6.700,respectively,P0.05)．ThegenotypefrequenciesofPhe54LeuweresimilarwithLys940Arg,butitdidn¡tincreasedriskofgastriccancer.ConclusionThefindingssuggestthattherebeastrongcorrelationbetweenPARP-1geneLys940ArgpolymophismandsusceptibilitytogastriccancerinhexiareaofGansuprovince,whilenoanysignificantassociationsbetweenPhe54Leupolymorphismandtheriskofgastriccancer;simultaneously,1单勇,男,1975-,兰州大学在读硕士,研究方向:消化道肿瘤.2通讯作者:李玉民,男,教授,博士生导师.730000,兰州大学第一医院普外2科.lym19621225@hotmail.com1兰州大学第一医院，兰州（730000）¡Ggenotype.Furtherstudiesarewarrantedtoverifythesefindings.【Keywords】gastriccancer;p53;SNP;susceptibility近年来的研究表明，DNA修复基因的多态性与个体对胃癌的易感性有关[1,2]。人类细胞DNA的损伤是致癌的重要步骤。机体DNA修复基因在维持基因组功能整体性、修复致癌因素所致的损伤及抗癌过程中有着重要作用[3]。DNA损伤修复能力是影响肿瘤遗传易感性的决定因素，DNA损伤修复基因突变可能影响酶的功能及酶与参与DNA损伤修复的其他蛋白的相互作用而导致癌症易感性增加[4]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADPribose)polymerase,PARP]是一个能选择性识别并结合DNA缺口的DNA结合蛋白酶，主要通过修复DNA单链及双链断裂在维持基因组的完整性方面发挥作用[5,6]。PARP家族共有7个成员，PARP-1是第一个被发现，也是迄今为止研究的最清楚的一个成员。PARP-1是一个含量丰富的核内蛋白，它由三个结构域组成，即DNA结合区，自身调节区和NAD结合区。通过前后排列的两个N末端的锌指结构，识别并结合DNA缺口，并召集其他的DNA修复基因共同完成DNA的损伤修复[7,8]。胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。我国胃癌的发病率和死亡率高出世界水平两倍多，甘肃省又属我国胃癌高发区，尤其是河西地区，胃癌检出率为7.79%,死亡率居全国之首[9]。目前，普遍认为胃癌的发生是一个多基因、多步骤的复杂发展过程，是多种环境危险因素与基因共同作用的结果。大量研究已证实幽门螺杆菌(Helicobacterpylori．Hp)感染与胃癌高度相关，1994年国际癌症研究中心(LARC)将Hp列为I类致癌因子。关于PARP-1Lys940Arg和/或Phe54Leu多态性与胃癌易感性的研究国内外尚未见报道。本研究采用TaqMan实时荧光定量PCR方法，探讨甘肃省胃癌高发区人群PARP-1基因Lys940Arg、Phe54Leu多态性、Hp感染在胃癌发生中的作用。1、对象与方法1.1研究对象胃癌组140例，来自2007年甘肃河西地区（武威、金昌、张掖、酒泉）县、市级以上医院胃镜和/或手术病理切片确诊病例，其中男性104例,女性36例；选择同期同医院排除肿瘤和消化系统疾病的健康体检者125名,男性87例,女性38例，按年龄和城乡情况与病例频数匹配。具体见表1。所有研究对象均为在河西地区居住满20年以上的当地居民。应用统一调查表形式进行调查，包括一般特征、饮食、饮水史、吸烟饮酒史、消化系统疾病史及药物使用情况、胃癌家族史等。1．2方法1.2.1外周血基因组DNA的提取以标准静脉穿刺法获取外周静脉血2.5ml，保存于含有EDTA的抗凝管中。使用柱式血液基因组提取试剂盒(BBI，Canada)从外周血白细胞中提取基因组DNA，操作按说明进行，测定所提取DNA的OD260、OD280，-20℃冰箱保存。1.2.2PARP-1Lys940Arg、Phe54Leu多态性的检测以PrimerPremier5.0软件设计合成探针及引物，并由上海基康生物技术公司合成（详见表2）。PCR反应总体积为10ul，内含2¡TaqManMasterMix5.0µl，p53Forwardprimer(浓度10pmol/ul)与Reverseprimer(浓度10pmol/ul)各0.45ul，TaqManFamprobe(10pmol/ul)、TaqManHexprobe(10pmol/ul)各0.25ul，模板DNA2.0ul(100ngDNA)及去离子水1.6ul。反应条件：50℃预变性2min，然后95℃10min，95℃5s，60℃30s，共40个循环，最后72℃延伸6min。应用TaqMan实时定量荧光PCR方法检测（ROTORGENE3000实时定量荧光PCR仪），Rotor-Gene2软件判读结果。FAM通道检测到荧光信号为FAM标记探针，JOE通道检测到荧光信号为HEX标记探针；若两通道同时检测到荧光信号则为杂合基因型，同时根据散点图进行判别。实验中设阴性对照和阳性对照，基因分型实验在双盲状态下进行。采用单纯随机抽样法对10%样本进行重复基因型检测，获得一致结果（见图1，2）。表2PARP-1基因Lys940Arg、Phe54Leu探针及引物位点探针引物Phe54Leu位点FAM-CCACACTGGTACCACTTcTCCTGCTTC¨TAMRAP15'-GTGCAGTCGCCCATGTTTG-3'HEX-CCACACTGGTACCACTTgTCCTGCTTC¨TAMRAP25'-CAGAGAACCCATCCACCTCAAC-3Lys940Arg位点FAM-TCACATATCAGCAaGTTACCCAAGGGC¨TAMRAP15'-TGCCCTTGGAAACATGTATGAA-3'HEX-CACATATCAGCAgGTTACCCAAGGGC-TAMRAP25'-GAACGTCTACACCATCCAGACTAATG-3'abc图1实时定量荧光PCRPARP-1基因Lys940Arg位点基因分型图a为Lys/Lys(AA)型；b为Lys/Arg(GA)型；c为Arg/Arg(GG)型abc图2实时定量荧光PCRPARP-1基因Phe54Leu分型图a为Leu/Leu(GG)型；b为Phe/Leu(GC)型；c为Phe/Phe(CC)型1.2.3Hp感染检测取胃镜活检及手术切除标本，应用Warthin-Starry法(W-S法)判断Hp感染情况。无Hp检出者为阴性。结果由两位有经验的病理学医师同时认可判定。1.3统计学处理采用卡方检验进行各基因型和等位基因频率的分布差异比较及Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验；年龄比较采用t检