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第1页共9页JIS_Z_2801：2010抗菌加工产品-抗菌试验方法，抗菌效果概要本标准是在2007年第一次发行的ISO22196的基础上，为符合科技发展及实际情况等而做的技术内容变更所制定的日本工业标准。另外，在本标准中的斜体字或虚线下划线所标注的有关国际标准变更事项的说明。变更表格涵盖在此说明中，具体请详见附属表格JA。1、试用范围本标准除纤维制品及光触媒抗菌加工制品以外，对树脂制品，金属制品，陶瓷制品等抗菌加工产品(含中间产品)表面细菌的抗菌性试验方法及抗菌效果的规定。另外，防霉、防臭、生物腐蚀等仅次于抗菌效果的功能，不包含在本标准中。注：1.有些制品要从其使用用途、形状等来判断纤维制品的试验操作方法是否妥当，可参见JISL1902规定10（定量试验）。2.本标准就有关国际标准以及其相关程度所表示的符号含义，详见如下。ISO22196:2007，Plastics-Measurementofantibacterialactivityonplasticssurfaces（MOD），对其相关程度所表示的“MOD”是指以ISO/IECGuide21-1为基础，即表示“正在修订中”。2、参考文件下列标准和条款通过本标准的引用成为本标准，版本更新的标准适用本标准。JISK0050化学分析方法总则JISK0950塑料杀菌碟JISK0970按钮式液体用微量体积计JISK3800二级的生物安全装置JISK8101乙醇（99.5）（试剂）JISK8150盐酸JISK8180盐酸（试剂）JISK8263琼脂（试剂）JISK8576氢氧化钠（试剂）JISK9007磷酸二氢钾JISK9017磷酸二钾JISK9012纺织产品的抗菌性实验方法JISR3505玻璃材质的体积计JISZ8802pH值测定方法3、定义本标准使用了如下定义和术语3.1抗菌抑制产品表面细菌繁殖的状态3.2抗菌剂直接使用或混合在制品表面以抑制细菌生长的试剂。3.3抗菌加工以抗菌为目的的加工。第2页共9页3.4抗菌加工制品被实施抗菌加工技术的制品。3.5抗菌活性值（antibacterialactivity）加工产品和未加工产品进行细菌接种培养后的细菌数进行对数后的差值。3.6抗菌效果(antibacterialeffectivvness)从抗菌活性值判断抗菌加工产品的效果。4、抗菌加工产品的抗菌效果，根据本标准的试验方法得出，抗菌活性值为2.0以上可判定具有抗菌效果。另外，根据当事人之间的协定，2.0上下的数值均可以。5、试验方法5.1试验中的细菌试验中所使用到的细菌种类，可根据以下列表，对其细菌逐一进行试验检测。a)金黄色葡萄球菌b)大肠埃希氏菌也可使用与表1所示的菌种。表1试验用细菌的菌株细菌的种类菌株的保存号码保存菌株的部门Staphylococcusaureus金黄色葡萄球菌ATCC6538PFDA209PNBRC12732CIP53.156DSM346NCIB8625美国典型微生物菌种保藏中心食品药品管理部门日本技术评价研究所生物资源中心法国巴斯德研究所菌物保藏中心德国微生物菌种保藏中心英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心Escherichiacoli大肠埃希氏菌ATCC8739NBRC3972CIP53.126DSM1576NCIB8545美国典型微生物菌种保藏中心日本技术评价研究所生物资源中心法国巴斯德研究所菌物保藏中心德国微生物菌种保藏中心英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心5.2药品、材料，器具及装置本标准所试用的药品，材料，器具及装置，没有特别的规定，如下所示均可乙醇（C2H5OH）JISK8101规定的1级以上的物品牛肉浸膏微生物试验用的物品蛋白胨微生物试验用的物品氯化钠（NaCl）JISK8150规定的特级物品纯水适合第15修正日本药局方的基准的物品琼脂JISK8263规定的特级以上的物品酵母膏微生物试验用的物品胰化蛋白胨微生物试验用的物品葡萄糖微生物试验用的物品酪蛋白胨微生物试验用的物品第3页共9页大豆胨微生物试验用的物品卵磷脂微生物试验用的物品非离子表面活性剂吐温80磷酸二氢钾KH2PO4JISK9007规定的特级物品磷酸氢二钾K2HPO4JISK9017规定的特级物品氢氧化钠NaOHJISK8576规定的特级物品盐酸HCLJISK8180规定的特级物品棉花塞接种环尖端大约一个4mm的环点干热消毒器使保持温度在160至180℃高压灭菌器能保持121℃和103KPa的压力生物安全柜性能按照或等价于JISK3800pH计JISZ8802规定中所使用的pH计天平性能按照或等价于JISK0050净化操作台微生物实验用吸管精确度能达到或等价于JISK0970或JISR3505A级培养箱保持温度±1℃无菌培养皿内径90mm的玻璃器皿或是按JISK0950中规定规格无菌袋微生物测试振荡器（拍打机）微生物测试薄膜不能影响微生物生长和吸水、厚度不定，但可以吸附着使用。5.3杀菌方法试管、吸管等玻璃试验器具，呈碱性状态时用中性试剂冲洗即可，再用水充分洗净，待干燥之后再进行干热杀菌或者高压蒸汽杀菌处理。具体灭菌方法，详见下列a)至b).另外，接种环等需要火焰灭菌的情况下使用，详见c).a）干热杀菌将杀菌对象放入干热杀菌器，在170℃的情况下进行60分钟以上时间的杀菌，或在160℃的情况下进行120分钟以上时间的杀菌。但是干热杀菌完成后，杀菌的绵塞，包装物等被水浸湿时，器具不可再用。b）高压灭菌锅将水倒入高压杀菌器，把杀菌物放在铁丝网篮上，盖上高压杀菌器的盖子，加热，温度达到121℃（压力相当103KPa）后保持15～20分钟。加热停止，自然冷却到100℃以下后，打开排气，排去蒸汽，打开盖子，取出杀菌后的物品，如有必要的情况下在净化操作台内冷却。高压灭菌锅要防止受到培养基和化学试剂的污染，为了保持干净，有必要的情况下可以放到中性洗剂中洗净，再用水充分清洗。c）火焰杀菌将需要灭菌的物体或部分物体放到气体或者酒精的火焰中。接种环应加热到足够的红，试管应解除火焰2-3秒。第4页共9页5.4其它培养基使用如下所示组合的培养基。另外，如果成分相同，可以使用市场上销售的产品。a）细菌悬浊液用营养肉汤[1/500细菌悬浊液用营养肉汤(1/500NB)]准备纯水或者离子交换水1000ml，称取牛肉浸膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，放入烧瓶里混合，充分溶解。用纯水稀释500倍。，用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在6.8—7.2之间(25℃)，然后进行高压蒸汽杀菌。配好的1/500NB如果不马上使用，可放到5-10℃的温度下保存。超过一周以上的1/500NB不能使用。b)营养琼脂培养基准备纯水或者离子交换水1000ml，称取牛肉浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，放入烧瓶里混合，全部溶解后，用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在7.0—7.2之间(25℃)，加入琼脂粉15.0g，加热溶解，塞上绵栓，进行高压蒸汽杀菌。配好的培养基如果不马上使用，可放到5-10℃的温度下保存。不能使用超过一个月以上的营养琼脂培养基。c)平板计数琼脂/标准琼脂培养基准备纯水或者离子交换水1000ml，称取酵母膏2.5g，蛋白胨5.0g,葡萄糖1.0g，放入烧瓶里混合，全部溶解后，用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在7.0—7.2之间(25℃)，加入琼脂粉15.0g，加热溶解，塞上绵栓，进行高压蒸汽杀菌。配好的培养基如果不马上使用，可放到5-10℃的温度下保存。不能使用超过一个月以上的标准琼脂培养基。d)斜面培养基准备6-10ml溶解后的营养琼脂培养基b)注入试管内，塞上绵栓高压蒸汽灭菌。灭菌完成后，把试管放在干净的室内保持15°倾斜，让试管内的物质凝固。如果没有冷凝水，则重新溶解，凝固后再用。配好的培养基如果不马上使用，可放到5-10℃的温度下保存。不能使用调至超过一个月以上的斜面培养基。e)SCDLP肉汤准备纯水或者离子交换水1000ml，酪蛋白胨17.0g，大豆胨3.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢氧二化钠2.5g，葡萄糖2.5g，卵磷脂1.0g，放入烧瓶内混合，充分溶解后，添加非离子表面活性剂7.0g并溶解。用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在6.8—7.2之间(25℃)，高压蒸汽灭菌。配好的培养基如果不马上使用，可放到5-10℃的温度下保存。不可使用超过一个月的SCDLP（液体培养基）。f)磷酸缓冲液准备磷酸二氢钾34.0g放到烧瓶内，添加纯水或者离子交换水500ml进行混合，充分溶解后，用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在6.8—7.2之间(25℃)。进而，添加纯水或者离子交换水使之达到1000ml。高压蒸汽灭菌备用。不可使用超过一个月的磷酸缓冲液培养基。第5页共9页g)磷酸盐缓冲生理盐水溶液用生理盐水（0.85%氯化钠溶液）800倍的量稀释磷酸溶液，必要的情况下，注入试管或者三角锥瓶中，塞上绵栓进行高压蒸汽灭菌。调至后，不马上使用的放到5-10℃的温度下保存。不可使用超过一个月的磷酸盐缓冲液。5.5菌种准备菌种的转接要无菌操作，有必要时使用生物安全柜。一手持带有菌种的斜面培养基，另一手持接种环，用这只手拔出棉塞，然后用火焰对试管口和接种环进行消毒，用接种环碰触斜面培养基上的冷凝水使冷却，用接种环从培养基表面刮取部分菌种并在新的斜面培养基上涂开，划线涂抹成条状。此方法根据图1所示，用接种环的顶端置于冷凝水以分散菌种，从冷凝水底部到斜面上方方向，用蘸取冷凝水的接种环的顶端以Z形划线涂抹。图1菌种转接对试管口用火焰进行再次消毒，塞住棉塞保持原状。用过的接种环要进行再次消毒，转接的菌种在35±1℃下接种培养24-48小时，后储存在5-10℃温度下，一个月内进行转接，过程同上。菌种传代次数不能超过5次，从最初的菌种从管理部门获得计算。此外，当最后一次转接超过一个月或是更多，则不能被使用。另外，来自菌种管理部门的菌种，经过冷冻干燥、冻结等允许使用长期保存方法保存的情况下，为了保存菌种而进行菌种移植。在试验用时，不能使用超过转接5次的保存菌种。5.6测试菌种应无菌操作，注意器械、人员、工作环境的污染，必要的情况下使用生物安全柜。a）细菌预培养使用接种环从保藏的斜面菌种5.5转接到斜面培养基5.4d上，在35±1℃培养16-24小时，然后从此斜面使用接种环接种到另一个斜面培养基，在35±1℃下培养16-20小时。b）准备测试片测试片准备，如下。第6页共9页1.)把样品平的部分切成标准尺寸50±2mm（厚度为10mm以内）的正方形，如因产品形状问题不能准备，可以采用相同的加工工艺方法生成测试片。测试片尺寸没有特别规定，只要能被薄膜覆盖400－1600mm2即可。2.)将无抗菌加工的测试片和经抗菌加工测试片切成相同大小，准备6片无抗菌加工的测试片，使用3个测试片接种后马上测试活性细胞数值，另外3个计算接种24小时后的活细胞数。3.)在没有无抗菌加工测试片的情况下，可使用5.2中的薄膜。测试片的准备过程中可能会发生微生物污染，务必要注意制品间的相互污染以及制品被污染的情况。由于制品的形状导致测试片准备困难的情况下，可以使用原材料或者用同种加工方法制成平板形状的测试片。4.)无抗菌加工测试片准备不足的情况下，准备半数（3个）测试片，在24小时培养后的活细胞数测试中使用这3个无加工测试片，用薄膜替代无抗菌加工测试片，接种后马上测试活性细胞数。当半数（3个）测试片准备不足的情况下，可全部用薄膜替代。c）测试片清洗用纱布或脱脂棉粘上酒精全面的擦拭测试片b)2-3次，充分干燥。如果经过处理后测试表面变软、表层分开，如果影响实验结果，样片清洗会导致软化、表面涂层溶解及溶出，应该避免清洗，或用没有清洗的测试片，也可用其它适合的方式清洁。d）测试菌液准备用接种环挑取培养好的测试细菌a)，均匀分散到少量的1/500NB（营养肉汤）中，通过合适的方法使稀释液的细菌数量在2.5x105~10x105个/ml，使用这种菌液当做接种体。如果接种体没有马上使用