搜索
电镜生物样品制备技术重庆医科大学生命科学院许舸样品制备是电镜技术中一个重要的组成部分，是电镜工作中最繁重的环节。要学习掌握好细胞超微结构知识及应用电镜技术进行研究工作，都必须首先了解电镜的标本制备技术。透射电镜样品制备常规特殊扫描电镜样品制备常规特殊第一部分常规透射电镜样品制备技术透射电子显微镜的电子束穿透能力较弱，大多数标本无法直接在透射电镜下进行观察，必须切成厚度10-100nm的薄片方可使用。这种电镜观察的切片比光镜的切片要薄100倍左右，故称超薄切片（ultrathinsection）超薄切片制备过程示意图一、取材（一）取材要求：组织材料新鲜，防止各种原因引起的离体或脱离正常生活环境后的变化。（二）取材的要点是1、快：1min2、小：1mm33、利4、净5、冷：4℃6、准7、部位一致8、做好标记青霉素小瓶，固定液，手术器械（剪刀、镊子等）、双面刀片、牙科蜡板（或硬纸片）、装有冰袋的保温桶、标签纸、铅笔、牙签手术器械，双面刀片都需要干净，用酒精去除油脂，固定液、手术器械、双面刀片要预冷一、取材实验动物取材与临床活检取材的区别二、固定（一）固定的目的：利用化学或物理方法，使组织尽可能保存接近生命状态的结构。固定细胞内的各种成分，避免死后自身酶分解出现自溶，或外界微生物的侵入繁殖导致细胞的超微结构受到破坏。（二）固定方法：化学固定和物理固定能够固定细胞、组织结构的化学试剂称为固定剂。固定剂能和细胞内的大分子物质，主要是蛋白质发生化学结合形成交联，使蛋白成分得以凝固，同时也能保存糖类和脂肪，使其保持生活时的状态和位置，从而达到把细胞的精细结构保存下来的目的。二、固定（三）理想固定剂和良好的固定标准1、理想固定剂应具备的条件：穿透力强，不产生变形能够稳定细胞的结构和化学成分将细胞内的成分变为不溶状态使细胞内酶的活性和其它大分子物质的活性功能基团得以保存能够增强图像的反差2、良好的固定标准：细胞的膜系结构线条清晰，连续而不断裂，细胞基质充满密度均匀的精细颗粒，不见明显的空白区和颗粒聚集现象。细胞核结构层次清晰，无染色质不规则的聚集和异常的空白区。二、固定（四）影响固定的因素固定剂的pH值、渗透压、温度、固定液的浓度、用量、固定时间等（五）常用固定剂四氧化锇（Osmiumtetroxide，OsO4）；又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电子染色作用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化学实验的固定。对脂类有良好的固定作用，对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）；不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有“电子染色”的作用，通常用于前固定。甲醛（formaldehyde）电镜多用多聚甲醛，对酶活性保存好，可与戊二醛混合或单独用于细胞化学灌流固定或作为前固定液二、固定（六）固定方法1、浸泡固定法：适用于大多数样品。先用戊二醛做前固定，锇酸作后固定，称双固定法。2、体内原位固定法：多用于解剖关系比较复杂或对缺氧比较敏感的组织。3、灌流固定法：适用于取材困难的柔软组织，或难以浸透、死后变化快的组织和器官。如中枢神经系统，视网膜、肾脏等。可以做动物的全身灌流，或是器官局部灌流。三、漂洗目的：除去残留的固定液方法：缓冲液漂洗3次，10-15min四、脱水目的：使不溶于水的包埋剂能浸透入组织和细胞里方法：乙醇和丙酮逐级梯度脱水50％→70％→90％→100％（块染：70%饱和醋酸铀的乙醇溶液，4℃，1-2h或过夜）四、脱水•注意事项（1）脱水既要充分，又不能在无水乙醇或丙酮中停留时间过长。（2）根据材料的性质和大小，适当增加或者减少脱水时间。（3）如果脱水组织需要过夜，可将之置留于70%脱水剂中。五、浸透（一）目的：用包埋剂置换出样品中的脱水剂（二）方法：1、半浸透：100%脱水剂和包埋剂1:1混合2、纯浸透：纯包埋剂六、包埋、聚合（一）包埋的目的：让包埋剂完全浸透到组织内部，并在一定条件下聚合成包埋块，作为细胞结构的支架，有利于制备出超薄切片。（二）包埋剂1、理想的包埋剂应具备的条件（1）聚合前粘度适中，能较快渗入组织；（2）聚合均匀充分，聚合前后体积变化小，组织无变形，微细结构保存良好；（3）聚合后有良好的切割性，软硬适度易于调整；（4）能经受电子束轰击，高温下不易升华和变形；（5）高倍下放大不显示包埋剂本身的结构；（6）对人体无害，便于操作。六、包埋、聚合2、常用包埋剂环氧树脂类：（1）环氧树脂618：粘度大，对温度和湿度要求不十分严格（2）Epon812：粘度低，对湿度要求严格加速剂：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基苯酚）固化剂：DDSA（十二烷基琥珀酸酐）MNA（六甲酸酐）增塑剂：DBP（苯二甲酸二丁酯）六、包埋、聚合（三）包埋方法1、常规包埋2、定向包埋六、包埋、聚合（四）聚合37℃（16h），45℃（12h），60℃（14h）七、超薄切片术超薄切片术是应用超薄切片机制备出供透射电镜观察的超薄切片的专门技术，它是整个制样程序的中心环节。超薄切片的好坏与切片机的性能、切片刀的质量、包埋块的切割性能以及操作者的技术经验等因素密切相关。进行超薄切片前，必须做好一切准备工作，如选择和清洗载网、制备支持膜、制备玻璃刀、修整包埋块等，开始切片时必须心境平稳，精力集中，避免任何干扰（如随意离位、各种震动、人员往来、尘粒污染等）。七、超薄切片术（一）准备工作1、载网和支持膜（1）载网1）作用：承载样品,以便后续染色和观察2）种类：材质：铜网、不锈钢网、金网、镍网、尼龙网、碳网等形状：直径2-3mm，厚度20-50μm网孔数目：200-300目网孔形状：圆形、方形、单孔形、狭孔形等3）清洗七、超薄切片术（2）支持膜聚乙烯醇缩甲醛（Formvar）膜和火棉胶膜七、超薄切片术2、制刀（1）种类玻璃刀、钻石刀七、超薄切片术（2）玻璃刀制作七、超薄切片术PotentialKnifeEdge锋利的刀口Tip:Forcryo-ultramicrotomyknives,thisshelfshouldbe0.2mmorlessinwidth(formaximumsharpnessoftheknives).Forroomtemperatureplasticsectioning,theshelfmaybe0.5–1.0mmwide(foramorerobustknifeedge).七、超薄切片术七、超薄切片术（二）修块七、超薄切片术（三）半薄切片、染色及定位切片厚度：0.5-2μm染色：甲苯胺蓝七、超薄切片术（四）超薄切片装块、装刀、对刀、加水、切片、捞片七、超薄切片术七、超薄切片术七、超薄切片术切片厚度的选择灰色400-500埃银色500-700埃反差和分辨率均适中金色700-900埃紫色900埃以上七、超薄切片术（五）染色利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同程度的散射，以增强明暗之比（反差）而显示出各种超微结构，故电镜标本的染色称为“电子染色”。1、电子密度七、超薄切片术2、常用染色剂（1）醋酸铀（uranylacetate）又称醋酸双氧铀块染1-2h或过夜片染30min（2）枸橼酸铅（leadcitrate）片染，易被空气中的CO2污染第二部分透射电镜特殊样品制备内容:负染色技术电子显微镜细胞化学技术电镜酶细胞化学技术电镜免疫细胞化学技术真空喷镀技术冷冻蚀刻技术特殊样品制备一、负染色技术利用高密度无结构的重金属物质把生物标本包绕起来。这种反差是负像（与正染色的超薄切片相比较）。最常用的染色剂是磷钨酸钠（phosphotungsticacid，PTA），此法常用于病毒、蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究，制样简单，可作快速诊断。二、电镜细胞化学技术又称超微结构细胞化学，它借助细胞内的化学反应，研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况，以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的结构和功能的关系。广义的电镜细胞化学技术包括电镜酶细胞化学技术、电镜免疫细胞化学技术、特异酶消化印证技术、电镜放射自显影、超微示踪技术、X射线微区分析法等。二、电镜细胞化学技术（一）电镜酶细胞化学技术（electronmicroscopiccytochemistryofenzymeorultracytochemistryofenzyme）基本原理和内容利用酶催化反应特点，从亚微结构上研究酶的分布和活性。按其催化反应的性质可分为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构酶六大类，应用较多的有水解酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍此技术的主要过程和基本原理。初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。底物磷酸水解酶H3PO4最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。H3PO4捕捉剂（如Pb2+）Pb3(PO4)2↓最终反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易于观察并显示出酶的定位。近年来常用铈（Ce3+）作为捕捉剂。二、电镜细胞化学技术二、电镜细胞化学技术应用主要用于：（1）酶在超微结构上的定位，（2）标记和鉴定某些细胞和细胞器，（3）通过显示过氧化物酶，定位示踪HRP,（4）利用免疫酶技术，电镜下显示特异性标记物的定位。目前应用电镜技术常显示的标志酶有：各种细胞器的标志酶细胞器标志酶内质网核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高尔基体焦磷酸硫胺素酶（Trans膜囊）、烟酸胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（中间膜囊）溶酶体酸性磷酸酶微体过氧化氢酶线粒体细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氨酶细胞膜核糖核苷磷酸酶（如ATP酶）、碱性磷酸酶二、电镜细胞化学技术Figure10G-6-PasereactionproductswererichinLeydigcellofthecontrolgrouprats.×20000Figure11G-6-Pasereactionproductsdecreasedmarkedlyafter3dofcadiumtreatment.×20000Figure12ShowingintenseG-6-PasereactionproductsofLeydigcellafter3dofcadiumaddzinctreatment.×20000二、电镜细胞化学技术RER,G-6-PaseMito.,SDH二、电镜细胞化学技术（二）电镜免疫细胞化学技术简称免疫电镜（immunoelectronmicroscopy）是将光镜下的免疫组织化学、免疫细胞化学与各种电镜技术有机地结合起来，在细胞超微结构水平上研究抗原抗体反应，进行抗原的超微结构水平定性、鉴别和定位的一种技术。1、常用免疫电镜方法的原理PAP法（peroxidase-antiperoxidase）又称可溶性酶--抗酶法。特点为参加反应的抗体都不被酶直接标记。步骤：①第一抗体（Ab1）与组织中特异性抗原（Ag）相结合形成抗原抗体（Ag－Ab1）复合物；②用第二抗体（Ab2）的一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离，形成抗原--第一抗体--第二抗体（Ag-Ab1-Ab2）复合物；③用过氧化物酶--抗过氧化物酶复合物（PAP，与Ab1同种动物的血清）与第二抗体的游离Fab段结合，形成Ag-Ab1-Ab2－PAP复合物；④用过氧化氢和二氨基联苯胺（DAB）使PAP的过氧化物酶形成不溶的、暗棕色的嗜锇化合物。优点：①保存抗体活性好；②PAP复合物稳定；③敏感性高，比间接免疫荧光抗体法敏感性高100～1000倍；④由于敏感性高,节约了抗体用量,也减少了非特异性背景染色。缺点：①反应产物颗粒较大，遮盖背景；②DAB有致癌作用，操作中需格外小心；③内源性氧化酶对此法有干扰。ABC法基本原理：抗生物素--生物素--过氧化物酶复合物技术（Avidin-Biotin-PeroxidaseComplexTechnique）简称ABC技术，是目前常用的免疫细胞化学技术之一。1979年Guessdon首