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1上海水产大学生命学院周平凡光镜与电镜技术2第二部分:电子显微镜技术（电子显微镜和电子显微术的总称）3一、概述：第一章:电子显微镜的原理和结构第一节:几个常用的基本概念第二节:透射电子显微镜第三节:扫描电子显微镜第四节:其他类型的电子显微镜第二部分:电镜技术4第二章:超薄切片技术第一节:取材第二节:固定和固定剂第三节:脱水第四节:浸透和包埋第五节:超薄切片第二部分:电镜技术5第三章:电子染色技术第一节:电子显微镜标本的正染色第二节:电子显微镜标本的负染色第三节:半薄切片染色第二部分:电镜技术6第四章:扫描电镜生物样品制备技术第一节:取材和标本的预处理第二节:生物样品的干燥第三节:生物样品的导电法第二部分:电镜技术7一、概述89透射电镜TEM（transmissionelectronmicroscope）观察细胞内部结构扫描电镜SEM（scanningelectronmicroscope)观察组织或细胞表面的立体结构透射电子显微镜扫描电子显微镜电子显微镜的分类：10电子显微镜照片透射电子显微镜拍摄的照片扫描电子显微镜拍摄的照片细胞核红血球11一、概述12一、概述13电镜具有很高的分辨本领,能观察极微小的结构。但是电镜不能直接观察天然状态下的生物标本,必须通过各种技术将生物标本制成特殊的电镜生物样品,才能放入电镜进行观察,这些电镜样品制备技术称为电子显微术。电镜能在生物医学领域中广泛使用,在很大程度上是由于电子显微术的改进和发展。电子显微术种类很多,这里仅介绍几种常用的技术。一、概述14通过多种电子显微术的配合----能了解生物样品的化学组成、形态结构和生理功能的关系。电镜技术----无论在生物技术的基础研究中、还是在临床医学,都有着广阔的发展前景。一、概述15一、电子显微镜的概况透射电镜的点分辨率达到了2-3A,晶格分辩率已达到1A左右,已使人们能用电镜直接观察原子象；除透射电镜外,发展了多种电镜,如扫描电镜、扫描透射电镜、分析电镜等,使我们能对样品进行综合研究。一、概述16（一）透射电镜透射电镜----是利用电子射线穿透样品后放大而成像的一种电镜。主要优点----分辨率高,可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌,在生物医学上的应用最为广泛。加速电压----一般透射电镜（加速电压小于120KV）,高压透射电镜（加速电压在120KV与500KV之间）,超高压透射电镜（加速电压大于500KV）。一、概述17一、概述18二、电镜成象的原理19一、概述201、一般透射电镜：就是最常用的100KV电镜。这种电镜的分辨率高(点3A,晶格1.4A),但穿透本领小,观察样品必须很薄,如小于0.1微米的超薄切片、负染样品和复型膜等。这种电镜在生物医学上的应用已相当普及。一、概述213、超高压透射电镜：已有500KV、1000KV和3000KV的超高压电镜。这种电镜具有穿透能力强、辐射损伤小、可以配备环境样品室及进行各种动态观察等优点,分辨率也已达到或超过100KV电镜的水平。在超高压电镜上附加充气样品室,使人们有可能观察活细胞内超微结构的动态变化,对生物医学工作者很有吸引力。这种电镜庞大而且昂贵,远非一般实验室所能装备。一、概述22东京大学工学院125万伏超高压电镜（JEOL–ARM–1250），该电镜价值1000万美元，有三层楼那么高，是世界上精确度最高的电镜之一，主要用于原子结构和物质的特性研究。232425该电镜的开放管理时，该电镜的技术工作委员会主任市野漱告诉我们，他的电镜每天24小时向“全世界”开放。尽管是高精度特大型电镜，他们仍然实行用户经培训合格后自行上机的开放模式。原则上，电镜实行测试收费管理，但他们电镜开放的重点是从事高水平的测试服务与科学研究。26用户的样品不需要在这样高水平的电镜上测试，即便是付费，他们也不予测试，因为这等于是浪费了高水平的资源。相反，如果用户提出的样品或课题有很高的学术、科学技术价值，即便资费不够，他们也会主动接受。每年提供3％的运行费用。27可以根据用户项目水平的高低，他们可以采用合作方式开展测试研究，甚至免费提供测试和研究。正由于他们有这样的开放与合作原则，多年来，他们的电镜在高水平研究方面发挥了重要作用，取得了许多世界一流的学术成果。28用户提出的样品和研究有很高的价值，他们甚至可以提供几个月的免费食宿和测试，开展合作研究。正因为如此，他们也做出了很多高水平的成果，在全世界的同行中享有很高的知名度。29国外实验室倡导电子显微镜室对外开放：1、高年级学生2、研究生3、博士生4、科研人员303132UCLA纳米系统实验室333435363738394041424344454647484950（二）扫描电镜扫描电镜是利用电子射线轰击样品表面,引起二次电子等信号的发射,经检测装置接收后成像的一种电镜。特点是景深长,所获得的图象立体感强,可用来观察生物样品的各种形貌特征。在生物医学中,采用不同的样品制备技术可观察不同的结构,如用临界点干燥方法可观察样品的表面形貌；用冷冻割裂方法可观察样品割裂面的结构,用铸型方法可观察管腔内表面的结构等。一、概述51一、概述521、一般扫描电镜目前一般商品扫描电镜采用热发射电子枪,分辩率为60A左右,若采用六棚化镧电子枪,分辨率可提高到40-50A。这种电镜在生物医学中的应用也已相当普及。一、概述53一、概述54一、概述55（四）扫描透射电镜扫描电镜中电子射线作用于样品后,其中一部分电子可透过样品成为透射电子,将透过样品的透射电子和散射电子用检测器接收成像,即成为扫描透射电镜。这种电镜一般用场发射电子枪,兼有透射电镜、扫描电镜和分析电镜的特点,能观察较厚的样品,分辨本领和成象质量都很好,是近年来电镜技术的最大改进之一。一、概述561、超薄切片技术由于电子射线穿透本领很差,对厚于0.1微米的切片就很难透过。因此,必须把生物标本切得很薄才能在透射电镜下观察。超薄切片技术就是通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤,将生物标本切成薄于0.1微米超薄切片的样品制备技术,用于生物组织的内部超微结构研究。超薄切片技术是所有电镜生物样品制备技术中最常用、最基本的一种技术。（一）与透射电镜有关的电子显微术572、负染色技术利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷鸽酸纳、醋酸铀等）将生物标本包围起来,增强背景散射电子的能力以提高反差,在黑暗的背景下显示标本的形态结构,称负染色技术。这一技术操作简便,主要用于颗粒状标本（如细菌、病毒、分离细胞器等）的研究。（一）与透射电镜有关的电子显微术584、电镜细胞化学技术利用各种细胞化学反应,在超微结构水平上研究细胞成分的分布和变化的方法称电镜细胞化学技术。这一技术把细胞超微结构与其化学组成有机地联系起来,目前主要用于研究细胞内各种大分子物质和酶的定位等。（一）与透射电镜有关的电子显微术595、免疫电镜技术这是一种使抗原在超微结构水平上定位的技术,应用与抗原相应的标记抗体,在电镜下观察标记物的位置,从而定位相应抗原。这一技术有灵敏度高、特异性强的特点。（一）与透射电镜有关的电子显微术601、表面观察样品制备技术扫描电镜适合于研究生物样品的表面特征,样品制备包括观察面暴露、固定、干燥和导电等步骤,使表面特征充分暴露而不变形。这一技术是扫描电镜样品制备的常规技术,主要用于组织、细胞、寄生虫等表面形貌的研究。（二）与扫描电镜有关的电子显微术612、生物标本割裂技术将生物标本放在特殊包埋剂中经冷冻或其他方法国化,然后把固化的标本割裂,暴露组织和细胞的内部结构,再经干燥和导电后在扫描电镜下观察。这一技术使扫描电镜能观察生物标本的内部结构,目前最常用的是冷冻割裂技术。（二）与扫描电镜有关的电子显微术62（一）在细胞和分子生物学方面的应用电镜技术有力地推动了细胞生物学的发展,使许多在光学显微镜下长期不能解决的问题找到了答案。由于电镜具有很高的分辩率,使人们对细胞结构的认识不断深入,从光学显微镜的显微结构水平提高到超微结构水平。三、电镜技术在生物医学上的应用63对光镜下已经发现的细胞器如线粒体、中心体等的结构和功能,在电镜下有了新的和更深入的了解；对光镜下争论不休的细胞器如高尔基体,在电镜下得到了证实并作了深入的研究；在电镜下发现了很多新的细胞器和结构,如内质网、微体、微管、微丝等；电镜技术还对细胞的膜系统、细胞骨架和细胞联结的研究起着重要作用。采用多种电子显微术相结合,使人们能够对细胞各部分的结构、代谢和功能联系起来进行动态的研究,从而极大地丰富了细胞生物学的内容。三、电镜技术在生物医学上的应用64（二）在解剖学中的应用对人体结构的认识是医学的重要基础,而这一种认识是随着技术的发展而不断深入的。光学显微镜的出现使解剖学在大体解剖的基础上发展了显微解剖学（组织学）,电子显微镜的出现则进一步发展了超微解剖学,使人们对人体的认识达到了超微结构水平。三、电镜技术在生物医学上的应用65（三）在微生物学中的应用电镜技术在微生物学中的应用主要包括两个方面：对光学显微镜下看得见的原虫、真菌、细菌等作进一步的超微结构研究；对病毒的研究。现以病毒研究为例,说明电镜技术在微生物学中的应用。三、电镜技术在生物医学上的应用66（四）在病理研究和临床诊断方面的应用传统的病理学在疾病诊断上起着重要作用,但由于医学已发展到分子水平,原布的病理学知识已不能满足需要。近年来,随着电镜技术的发展,超微结构病理学和超微结构诊断学取得了很大的进展,有效地应用于病因研究和临床诊断上。三、电镜技术在生物医学上的应用67一、透射电子显微镜原理透射电子显微镜:简称“透镜”68透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscopeTEM）现代电子显微镜的基本形式69电镜与光镜主要区别显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMEM200nm0.1nm可见光（400-700）电子束（0.01-0.9）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差70透射电子显微镜中，物镜、中间镜、投影镜是以积木方式成像，如果电子显微镜是三级成像，那么总的放大倍数就是各个透镜倍率的乘积。M=M0*Mi*Mp电磁透镜的光学性质71在光镜中：光束透过样品时，由于样品与光子流的相互作用产生不同程度的吸收、反射、折射和散射，其中主要是样品各部分对光的吸收特性不同而形成明暗不同的像。吸收光线少的部位，其像明亮，吸收光线多的部位，像黑暗。电子显微镜与光学显微镜的区别72在电镜中：电子射线在几万伏的加速电压作用下，以极高的速度聚到样品上，高速的电子与样品中的原子发生碰撞，从而产生散射现象。由于标本中各部分结构的厚度和密度不同，电子束受阻和产生散射情况也不同，因此透过标本的电子束就有疏密的区别，射到荧光屏上就会出现明暗不同的影像。第二节：透射电子显微镜73电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高（electrondense）。反之，则称为电子密度低（electronlucent）。74样品中各部分质量厚度的差异会引起不同的散射，当均匀的电子束穿过样品时就受到样品上信息的处理，变成一束疏密相间的电子束。散射角度较大的电子在通过物镜光栏是就被去除了。在生物样品中细胞和组织主要由较轻的低原子序数的原子如碳、氢、氧、氮等组成，这些原子的电子散射能力很小。电镜成象的原理75成像电子通过样品时，所碰到的原子数目越多，散射的可能性就越大。散射量和样品的厚度成正比。原子核的大小和原子序数直接有关，就是和样品本身的密度有关。原子核越大，它带的正电越多，则核周围电子云中的电子也就越多，这样散射的机率就越大。电镜成象的原理76透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄