搜索
有机溶剂沉淀法分离摘要：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。[1]关键词：有机溶剂沉淀1.有机溶剂沉淀法的概念利用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀。2.有机溶剂沉淀法的原因有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。[2]3.有机溶剂沉淀法的影响因素(一)有机溶剂的选择在实际生产中，常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、氯仿等。丙酮的介电常数小，沉淀能力强；而乙醇无毒，广泛应用于药品生产中。(二)温度的控制有机溶剂沉淀时，温度是重要的控制指标。根据沉淀对象不同，采用的温度不同，为防止生物大分子在较高温度时发生变性，一般要求在低温下进行，同时还要考虑有机溶剂与水混合时的放热现象。(三)pH值等电点时，蛋白质的溶解度最低。在有机溶剂沉淀时，应选择pH值在等电点附近，但是pH值的控制还必须考虑目的药物的稳定性条件，一般生产中常用缓冲液来控制溶液的pH值。(四)离子强度在有机溶剂和水的混合液中离子强度是一个特别重要的因素。因为盐在一定的浓度范围内能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，使有机溶剂沉淀收率降低，因此当采用盐析沉淀法得到蛋白质或酶后，如需进一步用有机溶剂沉淀法纯化，一定要先透析除盐。[3]4.有机溶剂沉淀法的溶剂选择原则溶剂的选择原则就是：与水可以混溶，不与蛋白反应，沉淀效应良好，无毒等。一般就是乙醇丙酮。方法就是调节适当的pH，pH调节适当会使沉淀效果好很多，等电点附近比较好。加入前将有机溶剂低温处理，缓慢加入，边加边缓慢搅拌（可以冰浴），静置15min后离心。蛋白溶液浓度不要太低，否则蛋白容易变性，5mg/ml以上吧。一般加丙酮的话，体积百分含量20~50%即可。至于加盐的话，可以在加有机溶剂前加入，浓度不要太大，否则如你所说，沉淀太猛，失去分级的效果。如果加NaCl，浓度0.05mol/L左右即可。[4]5.有机溶剂沉淀法的主要机理向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。主要机理：（1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。(2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10μg/ml）直至极易溶解（＞300mg/ml）不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。使用的有机溶剂多为醇和酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。有机溶剂沉淀法的优点是是分辨能力比盐析法高，溶剂容易除去且可回收，沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂易使蛋白质或酶变性，常采用降低温度的方法进行有效控制，而且有机溶剂使用量大，溶剂的使用及回收；储存都比较困难或麻烦。[5]四、参考文献[1]俞俊棠.唐孝宣新编生物工艺学，2003[2]孙彦生物分离技术（第三版）.[3]严希康生化分离技术华东理工大学出版社1996年12月第一版[4]杨博,王永华食品与发酵工业2000，27（2）：76～79[5]谢继宏等华东理工大学学报，1997，23(3):270～274.