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固定化酵母细胞和传统发酵法生产啤酒的比较研究第四组：植保1002周鑫动医1104赵帝食工1103魏海涛应化1101万宣宣前言随着生物工程技术的发展，固定化酵母细胞发酵生产啤酒是当前啤酒生产的重大改革和发展方向。固定化细胞具有生长快，可连续使用的特点。越来越广泛的应用于发酵工业中，同时可实现可连续化生产，提高产品的转化率。所以，固定化酵母细胞与传统发酵法生产啤酒的比较有很重要的意义。麦芽汁的选择由于人工制作麦芽汁比较辛苦，本实验采用直接购买麦芽汁的方式。实验原理使用包埋法固定酵母菌细胞。酵母菌在不同的PH下发酵程度不同，我们组选择了PH为5.3和6.1的麦芽汁溶液。啤酒的发酵程度可以用残糖量和酒精度来测定。测定啤酒中所含的酵母菌可用平板计数法。实验前的准备实验前的准备主要是仪器的准备。1.发酵瓶5个（500ml)2.三角瓶（装有无菌水）1个3.试管（装有生理盐水）6个，3组4.枪头、离心管5.孟加拉红培养基3瓶6.培养皿10个，三组7.PH计，试纸，盐酸，烧碱酵母细胞固定和测定一、酵母细胞的固定（一）、基本原理本次实验使用包埋法来固定细胞，即将微生物细胞均匀的包埋在不溶于水的多孔的海藻酸钠胶体中。（二）、实验仪器和试剂仪器：100ml烧杯、500ml烧杯、磁力搅拌器、玻璃棒、量筒、恒温水浴锅、针筒、瓶子等。化学材料：活化酵母菌、蒸馏水、0.05mol/L的CaCl2溶液、2.8g海藻酸钠等。（三）、实验步骤1.称取酵母菌液，离心操作。2.称取1.7g无水氯化钙，放入500ml锥形瓶中，加入300ml无菌水，现配先用。3.称取0.7g海藻酸钠，放入100ml烧杯中，加入40ml蒸馏水，搅拌后放入磁力搅拌器，开始搅拌。4.将融化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已经活化的酵母细胞，充分混匀。5.用注射器吸取酵母细胞海藻酸钠混合液，以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配置好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成的凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。注：试验中要留出适量的酵母细胞海藻酸钠混合液，用于后面的细胞数目和活性的测定。6.配制麦芽汁，调节麦芽汁的PH。我们组借用PH计，用配制好的盐酸和烧碱溶液分别调节PH。最后，A组的PH为5.3，B组的PH为6.1.7.将制好的的胶珠均匀地放入A、B两瓶中，放入恒温箱中培养。啤酒相关测定残糖测量酒精度的测量发酵后溶液中含有的酵母菌数残糖的测定：糖度计测定法一、糖度计的工作原理光线从一种介质进入另一种介质时会产生折射现象，且入射角正弦之比恒为定值，此比值称为折光率。果蔬汁液中可溶性固形物含量与折光率在一定条件下（同一温度、压力）成正比例，故测定果蔬汁液的折光率，可求出果蔬汁液的浓度（含糖量的多少）。常用仪器是手持式折光仪，也称糖镜、手持式糖度计，通过测定果蔬可溶性固形物含量（含糖量），可了解果蔬的品质，大约估计果实的成熟度。手持糖度计一般是圆柱形的。二、手持糖度折光仪使用说明（一）、仪器结构①、折光棱镜②、盖板③、校准螺栓④、光学系统管路⑤、目镜（视度调节环）（二）、使用方法打开盖板②，用软布仔细擦净检测棱镜①。取待测溶液数滴，置于检测棱镜上，轻轻合上盖板，避免气泡产生，使溶液遍布棱镜表面。将仪器进光板对准光源或明亮处，眼睛通过目镜观察视场，转动目镜调节手轮⑤，使视场的蓝白分界线清晰。分界线的刻度值即为溶液的浓度。（三）、校正和温度修正仪器在测量前需要校正零点。取蒸馏水数滴，放在检测棱镜上，拧动零位调节螺钉③，使分界线调至刻度0%位置。然后擦净检测棱镜，进行检测。有些型号的仪器校正时需要配置标准液，代替蒸馏水。另一种方法是（只适合含糖量之测定）：利用温度修正表，在环境温度下读得的数值加（或减）温度修正值，获得准确数值。（四）、注意事项仪器系精密光学仪器，在使用和保养中应注意以下事项：1.在使用中必须细心谨慎，严格按说明使用，不得任意松动仪器各连接部分，不得跌落、碰撞，严禁发生剧烈震动。2.使用完毕后，严禁直接放入水中清洗，应用干净软布擦拭，对于光学表面，不应碰伤，划伤。3.仪器应放于干燥、无腐蚀气体的地方保管。4.避免零备件丢失。酒精含量测定：蒸馏—比重法1．原理（1）蒸馏去除样品中的非挥发性物质（2）收集馏出液，用水恢复至原重（3）用比重瓶测定20℃时馏出液的比重(相对密度)（4）查比重与酒精含量对照表即可得出试样中酒精含量的质量百分数。2．仪器附温度计比重瓶25ml3.测定酒精度的步骤1.取100ml的实验液于蒸馏瓶中，加入100ml的蒸馏水。2.将仪器装置连接好，打开加热装置。3.收集够100ml蒸馏液后停止加热，将蒸馏液倒入量筒中，冷却至室温后用酒精计测量其酒精度。4.对照酒精计的说明书读数。蒸馏装置蒸馏出来的液体4．注意事项（1）取样过程发酵过程测定：取样后立即用橡皮塞塞紧瓶口，防止酒精挥发。瓶装或听装成品酒要放在冰箱冷藏室中，冷至10－15℃备用。（2）样品过滤(如需要)和除气过程在样品过滤和除二氧化碳气体时，都应该在低于25℃的恒温室中操作。如果空调正开着时，一定要避开风口。。过滤时，在漏斗上加盖表面玻璃，接收瓶的瓶口要小，将漏斗下口插入接收瓶内与液面的距离要短，以防止酒精挥发。制备好的样，低温密封，2h内使用。（3）蒸馏过程500mm蛇形冷凝器冷却过程要防止中途停水或冷却水管脱落。接收馏出液的容量瓶要外加冰水浴在蒸馏初沸前要缓慢加热，防止酒液急剧沸腾，泡沫窜出在蒸馏过程中，要经常检查蒸馏装置的各个连接处（4）密度瓶的使用在每一次使用时都要进行外观检查（是否破损内外壁是否干净、干燥（特别是小帽子的内部））。密度瓶使用一段时间后要用酸性洗液浸泡清洗应持比重瓶颈，不得拿瓶肚。水浴恒温时禁止用手捂或放在室内自然升温，以免使比重瓶内溶液受热不均，产生较大误差。（5）天平称重感量0.1mg的分析天平罩内要放干燥剂，保持内部空气干燥称重的速度要快当室温高于20℃时，比重瓶内的溶液会升温而外溢，比重瓶外壁会由于温度差而产生露水，发生较大误差；称重时要戴薄型的尼龙手套，防止汗液粘附在瓶上。成品啤酒的感官评定外观取发酵得到的啤酒少量至于明亮处迎光观察，然后再倒入干净小烧杯中，借助于8倍放大镜与光亮处观察。对于有沉淀的酒样，则记录为清沉淀、沉淀、重沉淀等。有时啤酒虽透明，但也可发现小粒游动，可用离心机使浮游物沉淀后，再以显微镜进一步观察。记录为透明、清亮、微亮、微混及浑浊等。泡沫将原啤酒至于15℃水浴后保持等温,,将啤酒从距离玻璃杯口约3㎝处容量为250ml的清洁玻璃杯中,观察泡沫升起情况。记录泡沫色泽和粗细。等泡沫稳定后，测量泡沫高度，并进一步记录从泡沫稳定后到泡沫消失，露出酒面的时间，最后观察泡沫挂杯情况。根据观察的现象进行记录，如洁白、白、发黄、灰；细腻、较细腻、较细、较粗、粗大；挂杯、尚挂杯、不挂杯等。三、残留酵母细胞的测定(平板计数法)（一）实验操作：1.样本稀释液的制备：（选择适当的稀释度）2.平板接种培养：平板涂抹计数法3.结果计算：每克样品的酵母菌数（cfu/g）=同一稀释度的几次重复的菌落平均数*稀释倍数*10（二）具体步骤1.水浴加热孟加拉红培养基，使其熔化成液体。2.将实验液以合适的倍数稀释。（用无菌生理盐水）3.将配制好的实验液倒入已经标号的培养皿中，趁热倒入孟加拉红培养基，及时盖上培养皿的盖子。待培养基凝固后，放入培养箱中培养。4.待菌落长出后开始计数。实验结果1.糖度的变化分析7月1日7月3日7月5日7月7日A组4.03.73.13.0B组3.53.22.92.9结果分析：麦芽汁的糖度总体比较低，原因可能是在调节PH值时加入的液体过多。糖度呈下降趋势，说明在发酵过程中，酵母菌把麦芽糖转化成了其他物质。A组与B组相比，A组的变化较为明显，说明A组条件下的发酵效果较好。2.酒精度的变化及分析7月1日7月3日7月5日7月7日A组02.92.12.0B组02.52.11.1结果分析：酒精度的测定数据与理论值差距很大，主要原因是酒精计的使用有误差。蒸馏出来的水过多也会导致误差的出现。3.发酵后酵母菌数量数据A组固定化酵母细胞的实验液菌个数稀释倍数皿1皿2皿3135被污染201010811100273B组固定化酵母细胞的实验液菌个数稀释倍数皿1皿2皿31多不可计多不可计多不可计1028311510015132游离化酵母细胞的实验液菌个数稀释倍数皿1皿2皿310000005155501000000077111000000007225生理盐水的对照组上面的菌数均为零。结果分析A组与B组比较可知，A组的酵母菌数少于B组的酵母菌数，主要原因是PH为5.3的环境下更适合酵母菌的生长，因此游离出来的酵母菌较少。由实验可知，游离化酵母菌实验液中的酵母菌数远多于固定化的。A中的一组被污染，原因可能是在倾倒培养基时无菌操作不准确，或培养皿有问题。在同一种稀释程度下，平行数据差别有的很大，可能是由于菌液与培养基混合的不均匀。啤酒的感官鉴定发酵后的啤酒成深棕色，有酒精味道，同时含有麦芽汁的味道。倾倒时有少许泡沫。结果分析：此次试验由于时间不够长，发酵的并不是很成功，但是通过这个实验我们组大致研究出了啤酒酿造过程中的一些规律，如糖度的变化以及最佳PH。通过这个实验，我们学会了一些仪器的使用方法和一些实验操作。在实验过程中，我们小组团结协作，做的非常开心。实验锻炼了我们的创新性思维以及认真耐心的态度，我们在实验中收获了一些实验外的东西。