细胞培养的基本技术

1细胞培养基本技术[e-mail]→科研实验室→免疫学研究所→PPT下载2无菌操作技术体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。3消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)灭菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐剂抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic)无菌(asepsis)无菌技术/无菌操作(antiseptictechnique)TermstorememberTermstoremember:4无菌操作技术1.工作环境及表面的处理2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理3.实验者的操作技术4.培养液的处理5无菌技术概念无菌技术无菌区非无菌区相对无菌区无菌物品污染物品是指在医疗、护理操是指在医疗、护理操作过程中，防止一切作过程中，防止一切微生物侵入人体和防微生物侵入人体和防止无菌物品、无菌区止无菌物品、无菌区域被污染的技术。域被污染的技术。是指经过灭菌处理是指经过灭菌处理且未被污染的区域。且未被污染的区域。是指未经过灭菌处理是指未经过灭菌处理，或虽经过灭菌处理，或虽经过灭菌处理但又被污染的区域。但又被污染的区域。是指无菌物品自无菌是指无菌物品自无菌容器内一经取出，就容器内一经取出，就认为是相对无菌，不认为是相对无菌，不可再放回。可再放回。无菌区边缘向内无菌区边缘向内3cm3cm为相对无菌区。为相对无菌区。是指经过物理或化学是指经过物理或化学方法灭菌后保持无菌方法灭菌后保持无菌状态的物品。状态的物品。是指未经处理或消毒是指未经处理或消毒灭菌后又被碰脏的物灭菌后又被碰脏的物品。品。6【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。7【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。8【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。9101112【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。试管培养瓶培养皿滴管吸管13【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。接种环、接种针L形涂布棒14培养细胞的观察１．肉眼观察培养物颜色及混浊度15体外培养细胞的常见问题16171819２．倒置显微镜观察细胞生长状态20体外培养细胞的方式群体培养（massculture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。21群体培养（左）和克隆培养（右）22体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：231、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。24名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起25成纤维细胞26成纤维细胞272、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。28名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动29上皮型细胞30人大肠癌细胞HT-29系1.细胞种类：人大肠上皮粘膜癌；2.培养天数：传代后2天；3.放大倍数：电镜*；4.培养基种类：MEM/Ham-F121:1混合；5.细胞状态与特征：细胞呈贴壁生长，梭形或不规则形，伪足较多，生长较快。31衰退期细胞32衰退期细胞333、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。341.细胞种类：小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞；2.培养的天数：24h；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，边缘清晰整齐，贴壁生长。351.细胞种类：小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞；2.培养的天数：30h；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞形态不规则，向四周伸展伪足，边缘不清，贴壁生长。364、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。37新生24小时wistar大鼠皮质神经细胞1.细胞种类：大鼠皮质神经细胞；2.培养的天数：5天；3.放大倍速：倒置显微镜X200倍；4.培养基种类：DEME-F12＋N25.细胞状态与特征简述：神经细胞聚集成球，向外爬行生长，各神经球之间有丰富的神经丝联系。单个神经细胞胞体呈锥形或圆形，树突交错呈网，贴壁生长。38（二）悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。39概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)40人PBMC（PHA活化剂刺激16h后）：1.细胞种类：人PBMC；2.培养的天数：36h；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：淋巴细胞母细胞化并聚集。41人PBMC（经EB病毒转化后的淋巴母细胞）：1.细胞种类：人PBMC；2.培养的天数：2weeks；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：RPMI1640+15%胎牛血清（Hyclone公司)；5.细胞状态与特征简述：淋巴细胞母细胞化并聚集。42•根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：•1．悬浮生长细胞传代•离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混刀传代。•2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）•此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹•打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。•3．贴壁生长细胞传代•采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。细胞传代方法43贴壁生长细胞传代方法：•1吸光培养瓶中的培养液•2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）•静置2-10min（显微镜下动态监测）。•3吸去胰蛋白酶液，加入培养液。•4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。•5离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。•5吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。•6加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。•7将后者放入培养箱中培养。44细胞传代培养—消化法45细胞计数•培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。•血细胞计数器：手工计数细胞•血球计数仪：自动计数46细胞计数：1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。474849•任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。•在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。培养细胞活力测定50•台盼蓝法•活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；•用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；•方法：1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。51其他染色方法未固定凋亡细胞染色：台盼蓝法：AO/EB双染色法：致密浓染黄绿色：早期凋亡细胞，致密浓染鲜红色：晚期凋亡细胞，鲜红色膨大状：坏死细胞凋亡细胞固定后染色观察：MGG染色法：玻片晾干后用MGG染液染色20min，光镜观察Hoechst3325染色法HE染色法其他：AnnexinV/PI双染法：正常活细胞AnnexinV、PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死细胞AnnexinV/PI均高染TUNEL染色：检测细胞凋亡CFSE染色：检测细胞增殖MTT比色法：测定细胞相对数和相对活力52AO/EB双染色原理：AO能够透过细胞膜，把细胞核内的DNA染成绿色，细胞浆内的RNA呈桔红色。早期凋亡细胞的细胞膜尚完整，细胞浆发生固缩，细胞核固缩或碎裂，因此呈致密浓染的黄绿色，有的还可见碎块状。晚期凋亡细胞的细胞膜通透性增加，EB能够通过，使其呈鲜红色固缩体或碎块。坏死细胞不仅细胞膜不完整，而且线粒体肿胀，为鲜红色的膨大细胞。方法：25Ld离壁漂浮的细胞悬液与2μlAO