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第一章细胞工程简介第一节生物工程生物工程（生物技术）是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。3生物技术的内涵主要是：运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；发展相应的科学理论与工程技术。4主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程以及生化工程。现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化。5基因工程即重组DNA技术，指根据人们的意愿对不同生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合，再转入生物体内产生出人们所期望的产物，或创造出具有新遗传性状的生物类型的一门技术。细胞工程细胞工程是根据细胞生物学和分子生物学原理，采用细胞培养技术，在细胞水平进行的遗传操作。细胞工程大体可分染色体工程、细胞质工程和细胞融合工程。1、细胞培养技术2、细胞核移植技术3、细胞融合技术13酶工程利用酶的催化作用，采用适当的生物反应器工业化的生产人类所需要的产品或是达到某一特殊目的的一种生物技术。应用：天然酶的分离纯化及鉴定和生产酶的固化技术酶生物反应器的研制和应用14发酵工程指利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的一种技术。16蛋白质工程利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造，并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质。17生物化学工程主要研究将生物技术的实验室研究成果转化为生产过程中的带有共性的工程技术问题。18第二节细胞工程一、概念细胞工程（cellengineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。19根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。20动物细胞工程包括：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）。植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。21二、主要研究内容（一）动植物细胞与组织培养细胞培养、组织培养、器官培养应用1：用生物反应器大量培养人参等高价值生物的细胞，生产有效药用成分。应用2：制取许多有应用价值的细胞产品，如单克隆抗体、疫苗、生长因子等。231.动物组织细胞培养技术的建立1907年，美国胚胎学家R.Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维)细胞，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至今。Carrel(1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，还把无菌技术引到了组织培养技术中。作为他的技术标志是，他在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏细胞维持生存了34年，先后继代3400次，证明动物细胞有可能在体外无限地生长。1914年，Thomson创立了另一条完全不同的体外组织培养途径－器官培养法，以后又被Strangeways和Fell所发展。1940年，Earle建立了可以无限传代的一个C3H小鼠的结缔组织细胞系－L系。1951年，Gay建立了第一个人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系。252.植物细胞培养技术的建立作为一门技术，它必须具有一定的程序性。也就是说，它应该具有一定的技术模式。在这一阶段，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式，二是激素调控模式。26在植物育种上的应用将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以或无法获得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。快速获得特殊倍性材料；克服远缘杂交不亲和；克服杂种胚早期夭折；导入外源基因；突变体筛选；种质资源保存；种苗脱病毒与快速繁殖等。27（三）染色体工程按人们的需要来添加、削减、替换染色体的一种技术。动物染色体工程：对细胞进行微操作。植物染色体工程：杂交、回交以改变染色体。单倍体、多倍体育种：四倍体小麦、八倍体黑小麦31（四）胚胎工程对哺乳动物的胚胎进行人为的工程技术操作获得人们所需要的成体动物。技术包括：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外受精技术、胚胎培养、胚胎移植以及性别鉴定技术、胚胎冷冻技术等。322.转基因技术将外源基因整合到生物体内，得到稳定表达，并使该基因能稳定的遗传给后代的实验技术。37三、细胞工程主要应用（一）优质植物快速培育与繁殖（二）动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种（三）利用动植物细胞培养生产活性产物、药品（四）新型动植物品种的培育（五）供医学器官修复或移植的组织工程（六）转基因动植物的生物反应器工程（七）珍稀动植物资源的保存与保护（八）在遗传学、发育学等领域的理论研究（九）在能源、环境保护等领域的应用第二章细胞工程基础问题：1、组成细胞的基本元素有哪些？2、原核细胞与真核细胞有哪些区别？3、染色体与染色质有什么区别？4、什么叫细胞周期？5、什么叫细胞凋亡，什么叫细胞坏死？6、什么叫细胞全能性？7、什么叫细胞分化？8、什么叫持家基因，什么叫组织特异性基因？9、植物的组织可分为哪两大类？各自的定义是什么？10、什么叫无性生殖，什么叫有性生殖？11、植物的营养生殖属于其中哪一种生殖方式？12、被子植物的花由哪几部分组成？雌雄配子分别位于哪一具体位置？13、动物受精卵的早期发育一般都要经过哪几个阶段？第3章植物组织与器官培养3.1植物组织培养植物组织培养是指将植物组织（如花药组织、胚乳、皮层等）给予适当的培养条件下，诱导其长成新的完整植株的一种实验技术。植物组织培养再生的植物——“试管植物”。5进行植物组织培养，只需要少量的材料就能获得大量的植株，不仅可以节约大量的种子、肥料，还节约了大量的耕地，因此可以在工厂中进行育苗。63.1.2植物组织培养再生植株的途径1、器官发生途径2、体细胞胚发生途径3.1.2.1器官发生途径植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的过程。8植物细胞脱分化是已有特定结构和功能的植物组织的细胞，在一定的条件下被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程。9愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团。即由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。愈伤组织细胞是分化的，但还没形成组织上的结构，因此愈伤组织培养过程中没有明显的组织或器官上的分化。愈伤组织可以用继代培养的方式长期保存，也可以通过悬浮培养而迅速增殖用作无性系；也可以用作原生质体培养时原生质体的来源。10外植体：植物体上切取下来进行培养的部分组织或器官。即植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。11离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过四个生长阶段。（一）启动期：诱导外植体细胞脱分化和分裂。（二）外植体经过诱导形成愈伤组织。（三）拟分生组织的形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。（四）器官原基及器官形成。12通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：第一种方式是先芽后根:第二种方式为先根后芽:第三种方式是同时生根发芽:在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。13在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种情况：一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养；另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。14研究表明，在叶肉细胞再生植株过程中，最初分裂细胞的第一次分裂轴向是十分重要的。在不经过愈伤组织的器官分化中，这次平周分裂既是叶肉细胞的脱分化，同时也是该细胞转变发育方式极性的确定。现在，有人把最先启动分裂的这些细胞称之为感受态细胞。15植物组织培养的基本步骤（一）培养材料的采集（二）培养材料的消毒（三）制备外植体（四）接种和培养（五）根的诱导（六）练苗16（一）培养材料的采集1、受精卵2、发育中的分生组织：根尖、嫩茎、幼叶、花3、雌雄配子、单倍体细胞其中茎尖最常用。（二）培养材料的消毒1、自来水冲洗蒸馏水冲洗无菌纱布或吸水纸吸干水分消毒刀片切成小块。2、70%酒精浸泡消毒30-60s。3、漂白粉饱和液或0.01%升汞水中消毒10min。4、无菌水冲洗3-4次。（三）制备外植体在无菌环境下，将已消毒的材料用无菌刀、剪、镊等，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳（叶片不需剥皮）。然后切成0.2-0.5cm厚的小片。操作中严禁用手接触材料。（四）接种和培养1、接种：无菌环境下，将切好的外植体立即接种在培养基上，每瓶接种4-10个。2、封口：接种后，瓶、管用无菌棉或盖封口，培养皿无菌胶带封口。3、温度：25℃左右。4、增殖：在新梢形成后需继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中。（五）根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转入生根培养基中进行生根培养。1月后可获健壮根系。（六）练苗先将培养容器打开，于室内自然光照3天，后取出小苗，自来水冲洗掉根系上培养基，栽入消毒后的基质中。移栽前注意遮荫，水分管理，保持较高空气湿度。233.1.2.2体细胞胚发生途径离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。这一定义有以下几方面的界定：其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别于离体培养中器官发生形成个体的途径。24（一）体细胞胚的形成途径1．体细胞胚从外植体上直接发生茎表皮、叶、子叶、下胚轴等外植体分化细胞经过脱分化后均可以产生胚状体。如：在以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成可分为两个阶段：1）诱导期。在此阶段中，叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激，进入分裂状态。2）是胚胎发育期。在这一阶段，形成的瘤状物继续发育，经过球形胚、心形胚等发育过程，最后形成体细胞胚。252．悬浮培养细胞的体细胞胚胎发生在胡萝卜细胞悬浮培养中，体细胞胚胎形成的细胞学观察表明，其培养物中存在两种类型的细胞：一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞一般不具备胚胎发生潜力；二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。26胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其外围的许多细胞开始第一次不均等分裂，靠近细胞团方向的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体细胞胚。通