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11、为什么说动物细胞工程技术的发展在为人类造福的同时也对人类提出了新的挑战？细胞工程技术可以创造一些原来没有的有生命活性的细胞，为医学上提供恢复病变缺陷细胞的功能成为可能，为人类健康提供福音，但也会出现一些新的基因组合，可能出现一些新的病变的可能，因此，要利用其为人类造福的同时，也要能应对其潜在的威胁。2、哺乳动物的克隆方法有哪些？（1）胚胎干细胞核移植；（2）胚胎细胞核移植；（3）胎儿成纤维细胞核移植；（4）体细胞核移植3、胚胎工程的意义（1）发挥优良母畜的繁殖能力——胚胎移植技术是提高母畜繁殖潜力的有效方法，扩大良种雌性配子的推广利用。（超数排卵、同步发情）。（2）促进家畜改良的速度（泌乳高的奶牛、瘦肉型猪、毛肉兼用的细毛羊等）。（3）作为胚胎操作的基础（卵子切割、性别控制、嵌合体制作、细胞核移植、转基因操作等）。（4）保存遗传资源——胚胎超低温冷冻技术的运用，给长期保存和运输、异地移植带来方便，还可用于建立“胚胎库”等。4、动物细胞培养基成分有哪些？（1）氨基酸类（2）维生素类（3）大量元素----是调节培养液渗透压的主要成分。（4）微量元素-----由血清提供的，在低血清或无血清培养液中，则需添加铁、铜、锌、硒等微量元素。（5）葡萄糖----能量来源之一，也是某些氨基酸合成的原料。（6）有机类（7）激素类----血清中含有许多激素。（8）生长因子类5、如何正确应用动物克隆技术?（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源6、你如何看待动物克隆问题？克隆技术对人类来说，是一把“双刃剑”。一方面，它能给人类带来许多益处，诸如保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等；另一方面，它将对生物多样性提出挑战，生物多样性是自然进化的结果，也是进化的动力，有性繁殖是形成生物多样性的重要基础，而“克隆动物”则会导致生物品系减少，个体生存能力下降。7、多莉羊是怎样培育出来的？为什么说她是克隆技术的里程碑？将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。在理论上证明了，分化了的动物细胞也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的。它是通过特殊的体外操作（显微注射、电融合、体外培养等），对哺乳动物特定发育阶段的核供体（胚胎卵裂球或体细胞）及相应的核受体（成熟的卵母细胞）进行体外重组，从而不经过有性繁殖过程而达到扩繁同基因型哺乳动物胚胎及其种群的目的。8、培养细胞的主要污染与排除（1）细菌的污染及检测。当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、崩解死亡。（2）真菌的污染及检测。真菌污染最为常见，污染也容易发现。在培养液表面会出现白色或浅黄色漂浮物。显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝。（3）支原体的污染及检测。支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行检测。（4）病毒的污染及检测。病毒的污染主要是通过DNA的整合，改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长或干预实验结果的准确性。对病毒的检测主要有直接观察、动物接种检查、电镜观察、免疫学及PCR法。（5）细胞交叉污染及检测。在培养的细胞中混杂有其它细胞，从而对培养的细胞产生形态或生长特性等方面的影响。常采用形态观察或检查细胞的标记物进行检测。有效防治采取的措施：1）严格操作，器具分明，空间隔离；2）细胞的取放严禁接触培养液瓶口；3）对培养的细胞要有充足的储备。9、血清的主要用途及注意事项（1）维持体外细胞生长；（2）提供细胞生存、生长和增值所必需的激素和生长因子；（3）补充基础培养液中没有或量不足的营养成分；（4）含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面粘附和铺展的生长基质成分；（5）还能为细胞提2供载体蛋白，补充细胞外基质；（6）血清中还含有糠蛋白酶成分，起到中和作用；（7）为培养液提供良好的缓冲坏境；（8）血清还有一定的黏度，可以保护细胞免受机械损伤。10、细胞培养的作用意义（1）有害物质的快速检测；（2）大面积皮肤烧伤的修复；（3）遗传病的产前诊断；（4）建立各种医学模型；（5）大量生产生物活性物质；（6）细胞与细胞之间的相互作用；（7）细胞内部与细胞外界之间的作用；（8）细胞内胞质的活动；（9）胞质与核质之间的流动11、细胞培养液配置的技术要点（1）水：水对维持培养细胞的生命活动是十分重要的。在培养用液中任何对细胞有害的杂质都会影响培养细胞的生存。一般培养细胞用液需用新鲜三蒸水配制。（2）平衡盐液：由生理盐水和葡萄糖制成，用于维持细胞渗透压、调节培养液酸碱平衡。常用Hanks液和Earls液。（3）培养基pH调整液：常用不同浓度的NaHCO3液。（4）细胞消化液：主要有胰蛋白酶溶液和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。使用时通常将二者按不同比例混合。（5）抗生素溶液：常用抗生素有青、链霉素、卡那霉素和制菌霉素。（6）消化酶抑制剂：在无血清培养时加入消化酶抑制剂，可以保护细胞免受残留消化酶的过度消化作用带来的影响。（7）谷氨酰胺补充液：在细胞代谢过程中起重要作用，一般配置为100倍的浓缩液，配置时应加温至30℃。，完全溶解后过滤除菌，分装成小瓶-20℃储存。12、核移植的技术要点、应用与发展前景（1）技术要点：①受体体细胞的准备。受体为成熟的卵细胞。采用机械法（剥离）或化学法（胰蛋白酶）去卵膜，然后用玻璃微针挑出细胞核或紫外线照射使核物质分解以达到去核的目的。②供体细胞的准备。供体通常选用：胚胎细胞——发育至32-64个卵裂球的胚胎细胞；胚胎干细胞——来自胚胎内细胞团成年动物体细胞。其共同的特性是细胞核具有全能性。③移核。选择合适的微吸管穿过透明带注入去核卵母细胞中，避免移入过多的细胞质、控制温度，短时间内完成。还可用供核细胞和卵母细胞的融合实现核转移。④融合和激活。融合是指用某种方法使核与胞质融为一体的过程；激活是通过某种刺激使卵子内钙离子浓度升高，给卵一个启动信号，促使细胞周期的恢复。（2）应用：①制备转基因克隆动物，进行生物药物生产；②培育优良品种，扩大育种种群；③开展异种动物克隆，拯救濒危动物；④与干细胞技术相结合，开展医疗性克隆；⑤用核移植技术，研究生物学的基本问题。（3）前景：核移植技术正在不断被人们接受,并已用于治疗性克隆和动物实验研究。随着人们观念的改变和技术的不断完善,核移植技术的应用范围将不断扩大,具有广阔的应用前景13、动物细胞工程主要有哪些内容？这些技术有何用途？答：1.组织和细胞培养技术2.细胞融合与单克隆抗体技术3.细胞核移植技术4.胚胎工程技术5.干细胞技术6.转基因技术7.染色体工程细胞工程的应用有：A.单克隆抗体的应用：疾病诊断与治疗、微量大分子物资的检测、贵重生物活性物的分离与提纯、特殊疾病治疗、与药物交联治疗疾病；B.转基因技术的应用：建立疾病的动物模型、品种改良和抗病育种、“乳腺生物发应器”、基因代替治疗、异种器官移植、基因功能研究；C.细胞与组织替代治疗；D.治疗人类不孕症；E.优良品种繁育；F.生产转基因家畜；G.保护濒危动物。14、每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期？各期细胞有何特点？每代细胞从开始接种到分离再培养，一般要经过以下阶段：潜伏期、指数(对数)生长期和停止期(平台期)。①细胞接种培养初期，历经悬浮、贴壁及生长加速的阶段。细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，贴壁出现标志悬浮期结束。细胞贴附于支持物后，会发生一系列变化，然后还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有生长活动，基本无增殖，少见分裂相。潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，标志细胞进入指数生长期。②又称对数期。此时细胞生长增殖旺盛，细胞成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞分裂相增多。（细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。）③在细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停止期。此时细胞数量持平，故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，可继续存活一段时间。该时期细胞形态轮廓增强，最后开始衰退死亡。15、简述单克隆抗体的制备过程及主要原理。针对某一抗原物质A设计一个研究方案，并制备相应的单克隆抗体。答：原理：在体液免疫反应中，一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇(即表位)，每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。基本3过程：先免疫动物，分离脾细胞，准备骨髓瘤细胞的准备，细胞融合，筛选与克隆融合细胞，最后大量制备单克隆抗体。方案：免疫动物：将处理好的抗原多次注射到BALB/c小鼠体内，每隔2天注射一次，第3~5天进行试采血检验血清中的抗体，同时可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋巴细胞逸出的方法采集淋巴细胞（大多为B细胞）。B细胞富集：将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的B细胞与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上，轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具有特异性抗体的B细胞，骨髓癌细胞的准备：用BALB/c小鼠的653。细胞融合：用PEG诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞间进行融合，操作在10min内完成；融合后马上以HAT培养，能活下来的大多为B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相互融合的细胞在HAT中因DNA合成抑制而死亡。未融合的B细胞及B细胞相互融合的细胞在体外培养因无法增殖会渐渐死去。使用抗原结合法对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选采用有限稀释法或软琼脂法对杂交瘤细胞进行细胞克隆化，获得来自单个细胞的克隆；并对单个细胞生长出的群落，再次以ELISA筛选专一性抗体，获得可产生特异性抗体的单克隆细胞株。用体内法大量制备单克隆抗体：可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所产生的腹水，通常每次可取得3～5mL左右。16、HAT的选择原理是什么？答：HAT系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞特殊的培养基。细胞内核苷酸的生物合成有两条途径：一条是主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成；另外一条是补救途径，该途径需要两种酶参与。一种是HGPRT酶(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)，另一种酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶)。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。因此，一个HGPRT－或TK－的细胞株不可能在含HAT的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞相融合，则杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。如将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；未