高效液相色谱仪使用与操作规程

高效液相色谱仪使用与操作规程第一步第二步第三步第四步准备开机注意事项清洁关机步骤第一步、准备1、准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。2、根据待检样品的需要更换合适的液相柱（注意方向）。3、配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）4、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。接通电源，依次开启不间断电源、四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。第二步、开机一）参数设定1、波长设定：2、流速设定：3、流动相比例设定：4、梯度设定：二）更换流动相并排气泡1：将吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；2：顺时针转动泵的排液阀180°，打开排液阀；3：运行泵，泵以3ml/min的流速冲洗5min（可设定）后泵流速设为0ml/min；4：将排液阀逆时针旋转适度拧紧，关闭排液阀。5：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。三）平衡系统用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操作。观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。四）进样1、进样前按软件中[零点校正]按钮校正基线零点。2、用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量即可以进样了。3、含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次。五）谱图的判断及结果计算1、系统适用性实验：①分离度：一般应≥1.5。②重复性：两次谱图的峰面积应相差不的过1%。③理论塔板数：应≥规定的理论塔板数目。④拖尾因子：0.95＜T＜1.05⑤保留时间：对照与样品的主成分保留时间应大致一致。⑥RSD：精密度＜3%。2、结果计算①外标法：②内标法：第三步、清洗管路及关机1、分析完毕后，先关检测器，再用经滤过和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水（5%甲醇），然后用甲醇-水冲洗，各种冲洗剂一般冲洗15～30分钟，最后用甲醇保留色谱柱，特殊情况应延长冲洗时间。2、冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。3、关断电源。第四步、注意事项二、样品1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；3、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；一、流动相1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质。第四步、注意事项三、色谱柱1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；2、使用符合要求的流动相；3、使用保护柱；4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；6、不要高压冲洗柱子；7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；使用过程中注意轻拿轻放。第四步、注意事项1、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；2、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；3、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；4、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；第四步、注意事项5、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯；6、关机时，自下而上关闭色谱仪各组件。第四步、注意事项四、使用经验交流（1）1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4、使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用超纯水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去盐分。第四步、注意事项四、使用经验交流（2）5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂(如甲醇)等清洗进样器。7.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法：①以异丙醇作溶剂冲洗；②放在异丙醇中间用超声波清洗；③用10％稀硝酸清洗。第四步、注意事项四、使用经验交流（3）8.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。9.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。10.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。11.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。高效液相色谱仪中常遇见的问题及处理方法一、保留时间变化1.柱温变化2.等度与梯度间未能充分平衡3.柱污染4.柱内条件变化5.柱快达到寿命1.柱恒温2.至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.每天冲洗柱4.稳定进样条件,调节流动相5.采用保护柱二、保留时间缩短1.流速增加2.样品超载3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度增加1.检查泵,重新设定流速2.降低样品量3.流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温三、保留时间延长1.流速下降2.硅胶柱上活性点变化3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度降低1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.流动相PH值保持在3～7.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温四、出现肩峰或分叉1.样品体积过大2.样品溶剂过强3.柱塌陷或形成短路通道4.柱内烧结不锈钢失效1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.采用较弱的样品溶剂3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品五、鬼峰1.进样阀残余峰2.样品中未知物3.柱未平衡4.水污染(反相)1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.处理样品3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水六、基线噪声1.气泡(尖锐峰)2.污染(随机噪声)3.检测器灯连续噪声4.电干扰(偶然噪声)5.检测器中有气泡1.流动相脱气2.清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.更换氘灯4.采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.流动相脱气,加柱后背压七、峰拖尾1.柱超载2.峰干扰3.柱塌陷或形成短路通道4.死体积或柱外体积过大5.柱效下降1.降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.清洁样品,调整流动相3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管5.用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱