荧光显微镜的基本使用方法

细胞生物学实验荧光显微镜的基本使用方法实验目的1.了解荧光显微镜的基本原理；2.掌握荧光显微镜的基本结构和使用注意事项；自发性荧光物质•神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光。•肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光。•某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光。•组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。•嗜中性粒细胞中脱氢酶辅酶呈现一定的荧光。荧光素激发波长发射波长DAPI372456AMCA350450Hoechst33258365465FITC490520AcridineOrange490590AcridineYellow470550CY3552565TRITC541572PropidiumIodide530615优点：检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的优点和用途实验原理光源激发滤色镜分色镜发射滤色镜（阻挡滤片）实验原理荧光显微镜的光路及主要部件光源激发光挡片激发滤色镜分色镜发射滤色镜Microscopeswithanupright-styleframearecapableofproducingfluorescenceilluminationeitherthroughepiscopicordiascopicopticalpathways,althoughthelatterisrarelyusedtoday.Epi-illuminatorsusuallyconsistofamercuryorxenonlamphousecoupledtoaverticalilluminatorthatispositionedabovethemainframeinaseparateassembly.Themicroscopenosepieceandtransmittedlightcomponents(diascopicilluminator,condenser,fielddiaphragm,filters,etc.)arebuiltintothemainframe,whilefluorescencecomponentsarehousedintheverticalilluminator.Theseilluminatorsoftencontainarevolvingorslidingturretthathousesfourtosixcubesthatcontainamixtureofinterferencefiltersincludingabarrierfilter,dichroicmirror,andanexcitationfilter.Asillustratedabove,lightemittedfromthelamppositionedintheepiscopiclamphousepassesthroughacollectorlensandthenthefieldandaperturediaphragmsbeforeenteringthefirstinterferencefilterinthecubeset,theemissionfilter.Thislightisthendirectedthroughtheobjectiveandontothespecimenbyaspecialdichroicmirrorthatreflectscertainwavelengthswhilepassingothers.Secondaryfluorescence,emittedbyfluorophoresresidinginthespecimen,travelsbackthroughtheobjectiveandthedichroicmirrorbeforepassingthroughabarrierfilterandintothemicroscopeeyepiecesorcamerasystem.激发光源•高压汞灯拥有313,337,365,405,436,546,and577纳米的峰值谱。高压Xenon灯有连续的可见光光谱范围,光源强度比较平均。汞灯光谱激发滤色块•具有多套激发滤色块：激发滤色镜（ExcitationFilter），分光镜（DichromaticMirror），发射滤色镜（EmissionFilter）。激发滤色块六孔激发块转盘多用途型BX-RFA(适合多种科研要求)及通用型BX-URA2。可同时使用6种荧光激发块，“轻拨式”激发块转换功能，使不同荧光激发之间的迅速转换非常方便，并可消除震动，有利于复染样品的荧光观察。激发块标识在暗室环境中发光，在暗室中也能很容易地选择需要的荧光激发块。另外，根据需要还可以选择6孔滤色片滑块(U-RSL6/U-RSL6EM)安放激发滤色片和发射滤色片进行荧光观察。BX51在镜基上装有3个滤色片（ND6，ND25，LBD），另外，还可以选装第四个。镜基侧面的拉杆可以很容易地插入/取出滤色镜。SpecimencolorfadingcanbedelayedbyreducingtheexcitationlightintensitywithNDfilters.UsetheNDfiltersasfarastheydonothinderobservations.InserttheNDfilters(U-25ND6and/orU-25ND25)withthemarkedsidefacingtowardtheobserver.1、该镜可作为明视场显微镜使用，也可作为荧光显微镜使用，根据需要，做相应的附件连接，开启相应的电源。禁止乱调设置，以免影响他人正常使用。2、作为明视场显微镜使用；A、接通电源后，打开显微镜底座前的电源开关，按光亮需要调节底座右侧的滑竿。B、根据需要，调节底座光栅和聚光器光栅及其高度，可获得最佳的图象效果。C、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。3、作为荧光显微镜使用；A、先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。B、等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。C、关闭显微镜光源，打开荧光通道。D、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。细胞核与细胞质DNA的直接荧光染色线粒体GFP转基因拟南芥根（显示叶绿体）叶片注意事项激发光挡片的使用----减少淬灭注意事项•荧光的淬灭与激发光的照射时间成正比，因此应尽量减少观察时间外激发光对样品的照射。激发光挡片可以部分或完全阻断激发光光路。在正式观察样品之前，激发光光路应该处于完全阻断状态。否则，在我们将样品放到载物台上，移动样品台将样品调整到物镜位置，找到要观察的细胞并进行调焦的过程中，样品上的荧光可能已经发生了相当程度的淬灭。为了避免观察前不必要的淬灭，上述一系列操作需要在透射光源下进行。•当眼睛离开物镜进行记录或将显微镜交给合作实验者观察时，要随手阻断激发光光路。实践结果表明，熟练、规范和合理的观察操作可以将样品淬灭对观察和记录造成的影响降低到最小限度。•荧光信号的淬灭还与激发光的强度成正比。因此，在可以观察到荧光信号的情况下，应该尽量降低激发光的强度。这样做还有利于降低背景。NOTES1.Theinsideoftheultrahigh-pressuremercuryburnerisveryhotandhazardousduringlightingandforabout10minutesafterturningoff.Donotopenthelamphousinginthisperiod.2.Themercuryburnerhasaservicelifeperiodof200hours(USH102D)or300hours(HBD103W/2).Whenthehourcounteronthepowersupplyunitindicatesthisvalue,setthemainswitchto“O”(OFF)andwaitformorethan10minutesbeforereplacingthemercuryburner.Unlikeelectricbulbs,themercuryburnersealshigh-pressuregasinside.Ifitcontinuestobeusedaftertheservicelifehasexpired,theglasstubemayeventuallyexplodeduetoaccumulateddistortion.思考题1．根据你的观察，荧光显微镜和光学显微镜除了使用同一个机架以外，还共用哪些部件？2．一台高质量的荧光显微镜在要求荧光信号充分明亮的同时，还需要没有信号的视野充分黑暗。请问视野的黑暗是怎样实现的？3.你在实验中观察叶绿体用的绿色激发光还是蓝色激发光效果比较好？说明其中的原因。